绵羊体细胞myostatin基因敲除及定点整合mAAT基因的初步研究

【摘要】： 基因敲除技术是建立在同源重组(homologous recombination, HR)基础之上对基因组进行遗传修饰的一种较理想的方法。结合现有转基因动物和动物克隆技术方面的经验，利用基因打靶技术，开展动物基因组修饰的理论和应用研究，即可定点进行基因修复、治疗遗传缺陷、基因敲除失活不利基因，还可最终解决动物乳腺反应器存在的随机整合率高而表达率较低的问题，实现定点整合及乳腺特异表达，为转基因动物的产业化生产创造条件，代表了当今动物遗传学发展的主流方向。为此，本研究以myostatin基因为靶向基因，mAAT基因为目的基因，Neo基因为标记基因，对绵羊体细胞基因敲除进行了一系列探索性的研究。 首先，利用长片段PCR扩增技术从优秀绵羊Dorset品种基因组中获得了基因打靶所需的同源臂序列，长度分别为1.374Kb和4.345Kb。其中4.345Kb位于羊myostatin基因的第Ⅰ、第Ⅱ外显子和第Ⅱ内含子区，1.374Kb位于myostatin基因的第Ⅲ外显子及其3’调控区。将两片段分别克隆到pMD-18T载体上，进行部分序列测定，并与羊、牛myostatin基因进行同源性比较。结果，与羊部分序列的同源性达100％，与牛相应序列的同源性为95％。说明扩增得到的确实是羊myostatin基因，完全可用于基因打靶载体构建。 摘 要 利用以上获得的同源臂序列，分别将其连接到 pLOXp载体上，构建 了正负筛选基因敲除载体pLOXpl．4K心．3K。将mAA基因序列连接到 酶切位点被修饰的pLOxp·1．4K43K A体的Mo基因后、同源右臂前， 得到一个插入型打靶载体pM·AAT。PCR和酶切鉴定结果均证明两个载 体的构建结果是正确的。 采用胰酶消化法和组织贴壁法分别建立了 乙个绵羊胎儿成纤维细胞 系sFFI－－8和4个雌性成年Dorset绵羊耳部成纤维细胞系DFI－4。采用 SRYWCR法对瑟个胎儿成纤维细胞系进行了性别鉴定，其中4个为雌性， 4个为阳性。同时跟踪检测了不同细胞代数的染色体核型。所建胎儿成纤 维细胞在体外培养35代、成年Dorset绵羊耳部成纤维细胞培养25代其 染色体核型正常率达70％以上，可以满足细胞转染和打靶的要求。 采用电击法和脂质体转染法分别对两种载体、不同细胞进行了细胞 转染及药物抗性克隆的培养筛选。从绝对效率来看，脂质体法优于电击 法，对较小DNA片段的转染效率也好于电击法Z 电击法对较大片段更适 合。采用PCR扩增法对药物抗性克隆进行了检测，转染pLoXp·1．4K心SK DM的细胞克隆中检测到3个为阳性，而转染pM一凶TDNA克隆中禾 能有效检出阳性，仅证明其药物抗性克隆中有mAA基因整合到绵羊染 色体上。对PCR检测阳性的细胞克隆进行了核移植试验，将105枚胚胎 移植到7头受体羊中，其中两头发育到2个情期来返情，一头发育到3 个情期未返情，初步说明以药物抗性细胞为核供体进行核移植得到的早 期胚胎发育良好。 摘 要 以上研究结果说明，对绵羊成纤维细胞进行基因修饰的技术路线是 可行的，但还需在如何提高打靶效率、体外培养的细胞系稳定性以及单 细胞克隆培养方法等方面进行更进一步的研究。