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分离哺乳动物XY精子的初步研究

陆阳清  
【摘要】:本研究的目的是探讨影响精子分离的因素,初步建立起流式细胞仪分离哺乳动物X精子和Y精子的程序和方法。 采集回来用于实验的精液,经过品质评定后用精子稀释液(TALP)稀释,与Hoechst33342在35℃水浴中孵育染色60 min,染色结束后加入食物色素(FDC#40)着色去除死亡精子,利用流式细胞仪根据精子核DNA含量的差别将X精子和Y精子分离。 结果发现:在精子分离之前,对黄牛新鲜精液分别进行直接保存、TALP稀释保存、TALP+Hoechst33342染色保存,在0h、4h时活率没有显著差异(P>0.05),8h时TALP+Hoechst33342保存的一组活率最低(61%),与另外两组差异显著(P<0.05),24h时新鲜精液直接保存的活率最好(60%),与另外两组差异极显著(P<0.01);用山羊断尾精子调试流式细胞仪,正确定向的断尾精子达到69%,在FL2H上X精子和Y精子分峰情况良好,各自CV均为~1.0%,用标准Beads检测CV达到了1.93%;山羊和水牛活精子染色时,Hoechst33342浓度至少分别为30μg/ml和40μg/ml,才能将DNA饱和着色,经过流式细胞仪分析XY精子DNA时呈现双峰;山羊和水牛的新鲜精液平均精子活率为86%和80%时,在10psi、20psi、30psi、40psi、50psi的鞘液压力下分离之后,平均活率分别为69%、67%、56%、22%、8%和73%、49%、22%、6%、3%,分离后精子的活率随着压力的提高而下降;水牛精子分离之后,利用重分析方法进行了4次分离准确率评定,X精子平均准确率达到94%,Y精子平均准确率达到89%。分离的水牛精子在5℃下保存20h后活率为67%,而在22℃下保存20h后分离精子的活率下降到了49%,二者差异极显著(P<0.01)。 以上试验结果表明,在目前的系统下已经初步建立起了流式细胞仪分离哺乳动物XY精子的方法和程序。


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