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广西猪繁殖与呼吸综合征病毒的分子生物学研究

蒋小红  
【摘要】:近来,广西一些养殖场频繁发生以母猪流产、死胎、木乃伊、仔猪呼吸道症状等为特征的流行性传染病,怀疑为猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)所致。本研究应用针对PRRSV的N基因的特异性引物P1/P2,通过RT-PCR技术对从广西南宁市郊区收集的仔猪病料进行检测,结果为阳性。将材料接种于易感细胞—Marc-145细胞,经过6代盲传,结果出现了典型的细胞病理变化(CPE),与对照株病变相似,经鉴定为PRRSV,成功地分离出广西第一株PRRSV毒株,命名为GXA株,其毒价为10~(5.33)TCID_(50)/ml。 参考VR-2332和OH-1a株基因序列,设计了3对引物E1/E2、M1/M2、N1/N2,分别扩增GXA株的E、M、N基因。并进行克隆和测序。结果分别扩增出大小为668bp、582bp和443bp的目的片段。应用DNAstar生物学软件对所测得的序列进行处理后,得到GXA株的E、M和N基因ORF全长分别为603nt、524nt和372nt,分别编码200、174和123个氨基酸。将此3个基因序列分别与国内外已发表的ATCC VR-2332、MLV、BJ-4和LV等13个毒株相应基因序列进行了同源性比较。结果发现GXA株与美洲型毒株E基因的核苷酸及其推定的氨基酸的同源性分别为88.7-99.7%和93.8-100%,与欧洲型代表株—LV株的核苷酸及其推定的氨基酸的同源性分别为64.7%和66.3%;GXA株与美洲型毒株M基因的核苷酸及其推定的氨基酸的同源性分别为94.5-100%和96.6-100%,与LV株的核苷酸及其推定的氨基酸的同源性分别为69.2%和78.9%;GXA株与美洲型毒株N基因的核 广西大学2004届硕士毕业论文 昔酸及其推定的氨基酸的同源性分别为93.8一1 00%和95.2一1 00%,与LV株的核 昔酸及其推定的氨基酸的同源性分别为66.3%和63.9%。同源性分析显示,GxA 株与VR一2332、劫LV和BJ一4的同源性非常高,而GXA与LV同源性非常低。构建 的系统发育树分析,GXA与VR一2332、MLV及BJ一4株亲缘关系比较密切。从而表 明GXA株属于美洲型毒株,可能来源于疫苗株。 将GXA株的E、M、N基因从重组质粒 pMD一E、pMD一M、pMD一N中亚克隆至原 核表达载体PE丁一32a上,构建了原核表达重组质粒PE丁一E、pE丁一M和PE丁喇,并 通过酶切鉴定,证实构建成功。


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