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生物酶法制备胶原小分子肽及其初步分离研究

瞿应良  
【摘要】: 胶原肽是由胶原蛋白酶解得到的肽混合物,由于胶原肽有着优良的加工特性、营养特性以及生物活性,在化妆品行业、食品行业等方面有着广泛的应用前景,胶原蛋白酶解产物胶原肽作为功能因子应用在化妆品中,分子量是最重要的影响因素,必须控制在1.5kDa以下。 以往胶原蛋白酶解制备胶原小分子肽存在:胶原蛋白酶解产物分子量分布较广,酶解产物中大分子胶原肽含量高等问题,束缚了胶原肽在化妆品中的应用。本论文采用两步复合酶解法,对胶原蛋白进行了酶解,极大地提高了酶解效率,解决了胶原蛋白难酶解,酶解产物分子量分布不集中等问题。 本研究以胶原蛋白为底物,从胶原蛋白结构入手;单因素实验筛选木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶和风味蛋白酶等作为水解复合酶;复合酶优选实验确定复合酶由木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶组成。通过单因素和正交实验,确定了最佳酶解条件:pH值为6.5、酶解时间为4h、温度为40℃、底物浓度为12%、木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶酶用量分别3000和2000U/g,酸溶性多肽得率和水解度分别为60%和5.26%。十二烷基硫酸钠—聚丙酰胺凝胶电泳表明:胶原蛋白酶解产物中大分子多肽主要集中在25.7~40.3kDa之间。 为了制备胶原小分子肽,胶原蛋白酶解产物采用由碱性蛋白酶和中性蛋白酶组成的复合酶进行了胶原小分子肽酶解研究。通过单因素实验确定了最佳酶解条件为:pH值为9.5,温度为50℃,时间为3h,碱性蛋白酶酶和中性蛋白酶酶用量分别为7000和4000U/g,酶解产物SEC-HPLC分析表明:酶解产物平均分子量为386.3Da,满足了胶原小分子肽应用在化妆品中对其分子量的要求。 用活性碳对酶水解产物进行脱色处理,以酶解液脱色率和多肽损失率考察脱色效果,得出活性炭对酶水解产物脱色的适宜条件:活性炭用量为1.5%、酶解液pH为5.5、脱色温度为35℃、脱色时间为40min,此时酶解产物脱色率为86.21%,多肽损失率为6.12%。 酶解产物分别采用截留分子量8kDa、20kDa超滤膜进行了处理,截留物SDS-PAGE实验表明:两种膜片截留物分子量都为37.6和32.5kDa。结合酶解产物分子量分布情况确定了超滤膜截留分子量为20kDa,通过单因素实验,确定了最佳超滤条件为:肽浓度39.1 g/L,压强0.5MPa,pH 5.0,室温超滤150min,分子量小于20kDa的酶解产物透过率达96.1%,透过物SEC-HPLC分析表明:分子量小于2kDa酶解产物峰面积99.79%。


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