山羊痘病毒P32基因跨膜区缺失载体的构建与表达

【摘要】： 本课题首先建立了羊痘与羊口疮二重PCR诊断方法，试验表明该方法特异性强、敏感性高，可检测到4pg的DNA模板，能很好区分症状相似的山羊痘和羊口疮，本试验检测了7份疑似山羊痘病料，检出山羊痘阳性6份，羊口疮阳性1份。对广西山羊痘6份阳性病料和国内现用的山羊痘疫苗株的p32蛋白的全基因进行了PCR扩增、克隆和测序，并将序列上传至Genbank中(序列号分别是EF522176、EF522177、EF522178、EF522179、EF522180、EF522181)，序列分析结果表明，广西分离株之间的核苷酸同源性99.4-100％，推导的氨基酸同源性为98.1-99.7％，山羊痘广西分离株与哈萨克斯坦AY077835、NC004003以及印度的AY382369、AY159333和中国哈尔滨的AY881707分离株的核苷酸同源性为99.6—99.9％，推导的氨基酸同源性为98.8—99.7％；与国内使用的疫苗株的核苷酸同源性为99.3-99.8％，推导的氨基酸同源性为97.8-99.4％；广西分离株、哈萨克斯坦的AY077835、NC004003，印度的AY382369、AY159333和中国哈尔滨的AY881707与现用的疫苗株相比，在34—35位都缺失了2个氨基酸；广西分离株核苷酸651位的碱基全部由T变为C，647-652位核苷酸构成由TGTATA变异为TGTACA，多了1个限制性内切酶Bsp1407Ⅰ位点，而疫苗株和国内及国外的AY077835、NC004003、AY382369、AY159333、AY881707在647-652位核苷酸都没有该限制性内切酶酶切位点，因此用限制性内切酶Bsp1407Ⅰ可以区分疫苗株与广西分离株，本文建立了PCR-RFLP方法，疫苗株可以切成135bp和604bp两个片段，广西分离株可以切成135bp、226bp和378bp三个片段。为了进一步研究P32基因，本研究利用重组PCR技术消除P32基因跨膜区，用DNAstar软件对跨膜区缺失前后的蛋白图谱分析可知，跨膜区缺失前后的蛋白跨膜区位置的折叠构象、螺旋发生了一定变化，但抗原性在缺失前后未见变化，因此构建了一个缺失片段的重组质粒pGEX-S6，把该重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)，用IPTG诱导进行原核表达，经SDS-PAGE检测表达产物，结果显示检测到P32基因的表达产物，用BandScan软件对表达产物分析，优化反应条件，最佳诱导时间为5h，IPTG最佳诱导浓度是0.8mmol／l，最佳诱导温度是37℃，优化后表达的蛋白占菌体蛋白的29.4％，表达产物以融合蛋白的形式存在，融合蛋白出现在沉淀中，分子量为58KDa，Western-blot分析结果显示，表达产物可被山羊痘标准阳性血清识别。