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木豆酸性磷酸酯酶的纯化与动力学特性

杨杰  
【摘要】: 以对硝基苯磷酸为底物,萌发的木豆种子粗提物经过硫酸铵分部沉淀、DEAE-Sephadex A25柱层析后得到两个有酸性磷酸酯酶活性的峰,分别收集这两个活性峰并经羟基磷灰石(HA)柱和伴刀豆球蛋白琼脂糖凝胶(Con-Sephorse 4B)柱层析进一步纯化得到两种酸性磷酸酯酶同工酶:纯化了51.3倍、比活力为10.8 U/mg蛋白的AcPaseⅠ;以及纯化了247倍、比活力为51.8 U/mg蛋白的AcPaseⅡ。非变性PAGE和变性SDS-PAGE检测AcPaseⅠ和AcPaseⅡ均呈现单一蛋白带,表明所获得的这两种同工酶都达到电泳纯,并且都是单亚基糖蛋白酶。SDS-PAGE法测定AcPaseⅠ分子量为32 kDa,AcPaseⅡ分子量为33 kDa。 AcPaseⅠ的最适pH为4.0,最适温度为50℃,pH在7.0以下,温度在50℃以下时酶活性稳定。以对硝基苯磷酸为底物测得AcPaseⅠ的米氏常数(Km)值为2.48 mmol/L,专一性常数(Vmax/Km)为1.47 U·mM~(-1)·mg~(-1)。AcPaseⅠ对PPi有较强的专一性,其米氏常数为0.15mmol/L,专一性常数为74.63 U·mM~(-1)·mg~(-1)。Fe~(2+)、Mn~(2+)和Ca~(2+)对木豆AcPaseⅠ有激活作用,高浓度的MoO_4~(2+)抑制AcPaseⅠ的活性,低浓度的Al~(3+)和MoO_4~(2+)对AcPaseⅠ的影响不大,5mmol/L Mg~(2+)、K~+、F~-、脲、Cu~(2+)、Fe~(3+)对木豆AcPaseⅠ有抑制作用,抑制效果为Mg~(2+)>K~+>脲>Cu~(2+)>Fe~(3+)F~+。 紫外光谱的研究结果表明:F~-、Mg~(2+)和Mn~(2+)使AcPaseⅠ吸收峰强度降低,高浓度的F~-使紫外吸收光谱有逐渐消失的趋势,高浓度的Mg~(2+)使紫外吸收峰有逐渐消失的趋势。Fe~(2+)和Cu~(2+)使酶的吸收峰强度明显增强,MoO_4~(2+)和Fe~(3+)使酶的紫外吸收峰值先增大后趋于稳定,并出现红移现象。蛋白变性剂脲在低浓度条件下使酶的吸收光谱强度降低。Ca~(2+)、Al~(3+)和K~+浓度增大对紫外吸收峰影响不大。 AcPaseⅡ的最适pH为5.0,最适温度为35℃。pH在3.5-7.0,温度在45℃以下时酶活性相对稳定。在55℃以上时,酶活力急剧下降。AcPaseⅡ对PPi活性最强,对ATP次之,对3-PGA最弱。K~+和Mg~(2+)能激活木豆AcPaseⅡ的活性。低浓度的Zn~(2+)(1mmol/L)对木豆AcPaseⅡ有弱激活作用,而高浓度的Zn~(2+)(5mmol/L)则抑制木豆AcPaseⅡ的活性。Fe~(2+)、Mn~(2+)、Ca~(2+)、MoO_4~(2-)、F~-、Al~(3+)、Fe~(3+)和Ba~(2+)对木豆AcPaseⅡ有不同程度的抑制作用,Cu~(2+)对其影响不大。AcPaseⅠ和AcPaseⅡ都被酒石酸、苹果酸、异柠檬酸、草酸、柠檬酸、乙醇酸、乙醛酸和抗坏血酸这几种常见的代谢物抑制。对酒石酸敏感可能暗示了他们都是紫色AcPase。


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