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鸡蛋蛋黄蛋白质制备降血压肽的研究

廖丹葵  
【摘要】: 血管紧张素转化酶在血压调节中具有双重的作用,它将无催化活性的血管紧张素Ⅰ转化为具有活性的血管紧张素Ⅱ,同时,它还可催化降压物质舒缓激肽分解从而导致血压升高。食品蛋白质中存在着活性肽,其中对血管紧张素转化酶具有抑制作用的活性肽(降血压肽)的研究在国内外尤其引人注目,它可通过酶水解食品蛋白质而获得。 采用鸡蛋蛋黄蛋白质为原料,经超临界CO_2-乙醇萃取出蛋黄油和卵磷脂纯化蛋黄蛋白质,得到含量为74.68%的蛋黄蛋白质,蛋白质含量较传统的溶剂提取法提高了24%。经SDS—PAGE法测定,得蛋黄蛋白主要由35kDa、40kDa、67kDa和100kDa以上分子量的蛋白质组成。 用12种蛋白酶酶解蛋黄蛋白质,结果显示所用酶水解产物对ACE皆具有抑制作用;采用体外保温抑制实验将其中活性较好的6种酶解产物进行筛选,确定了产物对ACE的抑制类型,并筛选出酶L为制备蛋黄降血压肽的酶类,其水解产物的IC_(50)为1.19mg/mL。 考察了各因素对酶解的影响,得到蛋黄蛋白质酶解作用最适水解时间为300min、温度为45℃、pH为9.5、底物浓度为60g/L、加酶量为0.42g/kg,此时蛋黄蛋白质水解度为17.2%,氮溶解指数为89.09%,平均肽链长度为6.5。建立了酶解蛋黄蛋白质的水解动力学模型,得到其动力学方程为r=(270.2E_0-0.4125S_0)exp[-0.23(DH)],动力学模型与实验结果吻合较好。 蛋黄水解液经活性炭脱色、采用截留分子量为10K和3.5K的超滤膜进行分离,所得蛋黄降血压肽超滤液对ACE抑制活性明显提高;用D61大孔阳离子交换树脂对分子量小于3.5kDa的水解液进行分离,确定了离子交换分离降血压肽的适宜条件为:采用pH4.1、浓度为0.05 mol/L的乙酸钠缓冲溶液+1.0mol/L的NaCl溶液,梯度洗脱,上样量为25mg/mL(湿树脂体积),洗脱速度为0.5mL/min,在此条件下,肽的得率与活性回收率分别为67.2%和73.59%。 用Sephadex G-15对离子交换树脂分离出的穿透峰和洗脱峰分别进行分离和纯化,用RP-HPLC分离纯化最大活性组分峰,用RP-HPLC和高效毛细管电泳(HPCE)进行纯度鉴定,经薄层色谱分析和电喷雾质谱鉴定表征了降血压肽EY-1的结构序列为Leu-Tyr-Pro。 蛋黄水解液的功能研究实验表明,蛋黄水解液有较好的耐热、耐酸稳定性,并发现不同分子量范围的水解产物具有较好的抗油脂氧化性能。与肠道酶作用结果表明,蛋黄水解液与胃蛋白酶作用后其IC_(50)值由1.19mg/mL变为0.94mg/mL,与胰蛋白酶作用后产物的IC_(50)则增至3.19mg/mL,活性有一定的损失,并经毛细管电泳肽谱图得到证实。


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