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铁皮石斛原球茎多糖的诱导、提纯、理化性质及生物活性研究

何铁光  
【摘要】: 多糖是石斛的主要药用成分。现代药理学研究表明,石斛多糖具有延缓衰老、增强免疫力、抗肿瘤、降血糖等多种药理活性。铁皮石斛(Dendrobium candidum Wall.ex Lindl)是石斛中的极品,具有益胃生津、滋阴清热、润肺止咳的功效。近年来,由于过度消耗,石斛野生资源已濒临绝迹。由此,提出铁皮石斛胚性组织原球茎(protocorm)替代其原植株成为药源的可能性。但迄今有关铁皮石斛原球茎多糖的研究尚未见报道。本研究旨在优化铁皮石斛原球茎生长和多糖积累的培养条件,了解铁皮石斛原球茎多糖的理化性质和生物活性。 研究结果如下: 1.铁皮石斛原球茎悬浮培养诱导高含量多糖的研究 (1)铁皮石斛原球茎生长、多糖积累以及营养物消耗的动态变化 为筛选适合铁皮石斛原球茎的最佳培养方式,对比了固体培养和液体悬浮培养这两种培养方式,并研究了液体悬浮培养基质的营养消耗趋势,同时分析了液体培养液中pH值和电导率的变化。结果表明:原球茎在固体培养条件下,培养60d后干重达到最大为13.40g/L,多糖产量最大值为2412.5mg/L,在液体悬浮培养条件下,干重需要50d达到最大为17.64g/L,多糖产量最大值为3081.2mg/L,液体悬浮培养在干重量、多糖含量和多糖产量等方面优于固体培养。在70d的周期内,悬浮培养原球茎以近“S”型曲线生长;原球茎在培养初期生长较缓慢,培养10d后原球茎生长进入快速生长期,原球茎干重量在第50d有最大值(17.64g/L),随后下降,60d后原球茎开始衰亡。多糖的积累与原球茎生长有一定的相关性,多糖含量从10d起开始逐步增长,30d达到最大(213.5mg/g·DW),而后迅速降低。在悬浮培养过程中,糖和磷的消耗速度较快,铵态氮优于硝态氮被吸收利用;pH值在培养前10d快速下降,随后又逐渐回升;在指数生长期,培养基中电导率降低与原球茎干重量增加之间有线性负相关性。 (2)不同因子对铁皮石斛原球茎生长和多糖积累的影响 MS、1/2MS、B5、N6和White培养基对原球茎的生长和多糖积累有不同的影响。其中,1/2MS和N6培养基适合原球茎生长和多糖积累。氮源浓度为30~60mmol/L,NO_3~—/Ha_4~+摩尔比为40∶20,30∶30时有利于原球茎生长和多糖积累。通过二次回归正交组合设计,优化拟合得到了激素6-BA和NAA的正交回归模型,通过寻优定量表明6-BA为1.25mg/L,NAA为0.52mg/L时,原球茎最大干重量可达14.68g/L;当6-BA与NAA组合的最佳浓度配比为1.41mg/L,0.36mg/L时,原球茎最高多糖含量为274.2mg/g·DW。在以转速、接种量、和pH三因素四水平的L_(16)(4~3)正交试验中,对原球茎生长影响最大的因子是pH,其次是转速,接种量最小。初始培养液pH为pH 7.0,摇床转速为110r/min,接种量为30g·FW/L适合原球茎生长;各因子对原球茎多糖积累的影响程度依次为转速、pH、接种量。初始培养液pH为5.0,摇床转速为110r/min,接种量为50g·FW/L有利于多糖积累。在葡萄糖,果糖,蔗糖和乳糖4种碳源中,蔗糖和葡萄糖对原球茎生长和多糖积累的影响优于乳糖和果糖。铁皮石斛原球茎生长和多糖积累所需的最佳蔗糖浓度不同。在蔗糖浓度为30~60g/L范围内,浓度越高,原球茎生长受到抑制越大,但多糖含量增加越快,含量越高;而蔗糖浓度高于60g/L时,蔗糖则呈现出明显的抑制作用,抑制了原球茎的生长,降低了干重量,但诱导了保护酶SOD的合成。当蔗糖浓度为30g/L时,该浓度适合原球茎的生长和多糖积累,最大干重量为17.93g/L,多糖最高含量为208.7mg/g·DW,培养40d时,其产量为3679.6mg/L。 (3)不同来源铁皮石斛材料多糖和氨基酸含量的分析 野生铁皮石斛茎中的多糖含量随年份不同含量差异较大,多年生茎中的多糖含量最高;茎、叶、根三个部位多糖含量不同,其高低顺序依次为茎>叶>根。铁皮石斛原球茎与野生植株茎中的多糖和总氨基酸含量相当,二者均含有7种人体必需的氨基酸,其中以野生铁皮石斛一年生茎中的含量最高,悬浮培养的原球茎含量次之,而野生铁皮石斛多年生茎的含量最低。初步显示组织培养物原球茎能弥补铁皮石斛野生资源的短缺。 2.正交设计优化铁皮石斛原球茎多糖提取条件 采用正交设计研究了原球茎多糖提取的条件,确立了Sevag法除蛋白的条件和不同的除蛋白方法。优化的多糖提取条件为:温度80℃,浸提2h,加20倍水,重提3次。Sevag法除蛋白的最适条件为:氯仿与正丁醇(v/v)的体积比为5∶2,粗多糖溶液与氯仿+正丁醇(v/v)的体积比为1∶0.35,反应时间为5min。交替应用木瓜蛋白酶法与Sevag法的除蛋白效果优于单独采用的Sevag法。 3.铁皮石斛原球茎多糖分离、纯化及理化性质 从铁皮石斛原球茎中提取,经醇沉、去蛋白质后得到的粗多糖(DCPP),分别上阴离子交换纤维素柱(DEAE-52)和凝胶柱(Sephadex G-200)依次层析,分离纯化得2个灰色的主要多糖组分DCPP1a-1和DCPP3c-1,DCPP1a-1和DCPP3c-1均为均一性多糖组分,分子量分别为189.0 kD、72.4 kD。DCPP1a-1由甘露糖和葡萄糖按7.015∶1的摩尔比组成,分子中1→6残基,1→2或1→4残基,1→3残基所占的比例分别为4.0%,52.1%和44.9%;DCPP3c-1由甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖组成,相对应的摩尔比为1.1204∶1∶1.046∶23.054∶3.828∶1.046,其分子中1→6残基占14%,1→2或1→4残基占40.7%,1→3残基占45.3%。两者的红外光谱显示有典型的多糖特征吸收峰,并存在α-吡喃糖苷键。多糖DCPP1a-1和DCPP3c-1是首次从铁皮石斛原球茎中分离纯化得到的两种新型组分。 4.铁皮石斛原球茎多糖体外对氧自由基和脂质过氧化的影响 铁皮石斛原球茎多糖具有较强的体外抗氧活性。粗多糖DCPP和2种纯多糖(DCPP1a-1、DCPP3c-1)在体外均能显著地清除·OH和O_2~-。多糖DCPP、DCPP1a-1和DCPP3c-1对·OH清除作用呈现较好的量效关系,抑制率达50%的浓度(IC_(50))分别为0.982mg/mL、1.181mg/mL和0.930mg/mL;DCPP和DCPP1a-1清除O_2~-的IC_(50)分别为0.619mg/mL、0.727mg/mL;DCPP3c-1在浓度为0.615mg/mL时,O_2~-有较强的清除效率,而后随着浓度的增大,清除率呈下降趋势;3种多糖均能有效地抑制肝组织自发性氧化和Fe~(2+)、H_2O_2诱导过氧化脂质的生成,以及小鼠肝线粒体的脂质过氧化物MDA的产生。3种多糖能减轻·OH所致的肝线粒体肿胀度,其抑制效果与浓度呈剂量效应关系。 5.铁皮石斛原球茎多糖体内抗肿瘤 粗多糖(DCPP)和纯多糖(DCPP1a-1)分别以低、中、高剂量按50mg/kg、150mg/kg、250mg/kg三个剂量对小鼠灌胃给药10d,二者对H_(22)肝癌小鼠均有不同程度的抑瘤作用。粗多糖DCPP的低、中、高三个剂量组对H_(22)肝癌小鼠的抑瘤率分别为22.6%、37.0%和14.9%,不存在剂量效应,中剂量组(150mg/kg)的抑瘤效果最好(p<0.01);DCPP1a-1对H_(22)肝癌小鼠的抑瘤率为15.7%~28.6%,抑瘤率与剂量呈负相关,其中低剂量组能显著抑制肿瘤的生长(p<0.05),抑瘤率达到了28.6%。原球茎多糖能提高肿瘤小鼠胸腺指数和脾指数,在低剂量下胸腺指数和脾指数增加效果显著(p<0.05),高剂量组的效果反而降低,但仍高于肿瘤对照组。多糖DCPP和DCPP1a-1在中剂量下,能显著提高小鼠血清中的SOD活性,降低MDA含量(p<0.05)。原球茎多糖通过提高机体免疫功能和抗氧化能力,抑制了肿瘤的生长。 本研究初步显示出离体培养的铁皮石斛原球茎可以为石斛多糖的开发提供新的药源。


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