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草甘膦对烟草超微结构的影响及烟草EPSPS Ⅰ基因克隆

汤洪  
【摘要】: 5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶(5-enolpyruvlyshikimate-3-phyosphate synthase,简称EPSPS)是由EPSPS基因编码的、存在于植物及细菌真菌莽草酸途径中的一种关键酶,它能催化植物及细菌真菌体内5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸(5-enolpyruvlyshikimate-3-phyosphate,简称EPSP)的生物合成,进而形成一些生命活动的重要代谢中间产物。草甘膦是农业生产中应用广泛的非选择性除草剂,它专一性抑制EPSPS活性,从而影响磷酸烯醇式丙酮酸(phosphoenol-pyruvate,简称PEP)与莽草酸-3-磷酸(shikimate-3-phyosphate,,简称S3P)结合生成植物及细菌真菌生长所需EPSP,阻断芳香族氨基酸和一些芳香化合物的生物合成。EPSPS对草甘膦抗性的获得可通过EPSPS基因过量表达、EPSPS基因点突变降低EPSPS对草甘膦的活性以及引入解毒酶基因。 本文主要进行了3个方面的研究:第一,研究了草甘膦对烟草叶片超微结构的影响,进一步探讨草甘膦与EPSPS的作用机制;第二,克隆了烟草EPSPSⅠ基因CDS序列;第三,优化了烟草愈伤组织培养体系,所获结果如下: 1、用30 mmol/L草甘膦处理烟草叶片2h、6h、12h、24h和48h后,分别取样和拍照,与对照进行比较,结果显示处理12h内烟草叶片外表无明显变化;24和48h后叶片黄化,并出现坏死。对各处理时期烟草叶片超微结构研究显示,草甘膦处理导致烟草叶片细胞叶绿体基粒片层结构被破坏;线粒体电子密度下降。这些结果提示草甘膦通过阻碍植物的光合作用和呼吸作用,导致叶片坏死。 2、克隆了EPSPSⅠ基因CDS全长序列,下一步将进行测序与转化。 3、优化了烟草愈伤组织的培养诱导体系,结果显示,选用叶片作为外植体可以迅速获得大量愈伤组织。


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