广西巴马小型猪生长素和脂联素基因的克隆及多态性分析

【摘要】： 生长素(Ghrelin)是由胃肠道分泌的一种多肽,最初发现其具有促进生长激素分泌的作用。随着研究的深入,发现它还有促进食欲、促进胃酸的分泌、也可能参与多种脂肪细胞因子相互作用,参与能量代谢等其他生物学作用,并可能参与肥胖的发病过程。脂联素(AdipoQ)具有降低血脂,降低血糖,改善胰岛素敏感性的作用,同时可拮抗动脉粥样硬化的形成。由于这些优点,adipoQ或刺激adipoQ分泌的药物可用于治疗与胰岛素抵抗有关的疾病和心血管疾病。本研究克隆了ghrelin基因和adipoQ基因的编码序列,为今后探讨广西巴马小型猪矮小体型的遗传机制提供分子水平上的理论依据;并利用PCR-SSCP技术研究了ghrelin基因和adipoQ基因的多态性,为寻找导致不同品种猪生长发育的遗传标记做必要的基础性研究。 本研究参照NCBI中GenBank发表的猪ghrelin和adipoQ基因的编码序列,设计特异性引物,分别以广西巴马小型猪胃底组织和脂肪组织总RNA以及基因组DNA为模板,通过反向聚合酶链式反应(RT-PCR)和引物悬挂延伸PCR法扩增出相应基因的cDNA片段。克隆测序结果表明:扩增得到的ghrelin基因cDNA序列为357bp,adipoQ基因cDNA序列为732bp,都包含了完整的编码序列;同源性比较发现,广西巴马小型猪ghrelin与GenBank中报道的猪ghrelin基因序列的同源性达到99.7%,与人类、家鼠及奶牛等物种的同源性分别为85.3%、81.4%、82.1%;广西巴马小型猪adipoQ与GenBank中报道的猪adipoQ基因序列的同源性达到99.7%,与人类、家鼠及奶牛等物种的同源性分别为86.6%、79.1%、84.5%。以上说明克隆得到了正确的广西巴马小型猪ghrelin和adipoQ基因的编码序列。测序比对发现ghrelin基因仅在编码序列的第335位(C→A)发生碱基错义突变,使编码氨基酸从苏氨酸变为天冬酰胺;adipoQ有2处碱基发生错义突变:其中第91位从C→T,使编码氨基酸从脯氨酸变为丝氨酸;第178位从G→A,使编码氨基酸从缬氨酸变为异亮氨酸。 本研究利用PCR-SSCP技术检测5个品种猪ghrelin基因的外显子3及adipoQ基因的2个外显子和内含子2的多态性。结果显示: (1)在ghrelin基因外显子3检测到3种基因型,分别为AA,AB和BB,其中陆川猪只有B等位基因;广西巴马小型猪只有A等位基因;而在杜洛克猪,长白猪,大约克猪等引进品种猪中,均检测到A、B基因,以等位基因B为优势基因,基因频率分别为0.633、0.575、0.667。多态信息含量大小依次为长白猪、杜洛克猪、大约克猪,均为中度多态;而陆川猪和广西巴马小型猪无多态。杜洛克猪和大约克猪χ~2值分别为3.9278(P＞0.05)和0.0650(P＞0.05),差异显著,说明杜洛克猪和大约克猪群体在该位点上处于Hardy-Weinberg平衡状态,其它三个猪群在该位点均偏离平衡状态。 (2)对5个不同品种猪的adipoQ基因进行多态性检测,在外显子区域未检测到多态性,而在其内含子2检测到AA、GG和AG三种基因型。其中,长白猪和大约克猪只有A等位基因;广西巴马小型猪和陆川猪均以G等位基因为优势基因,基因频率分别为0.925、0.861;而大约克猪检测到AA,AG两种基因型,其中以A等位基因为优势基因,基因频率为0.8。多态信息含量大小依次为杜洛克猪最高,为中度多态;其次为广西巴马小型猪和陆川猪,长白猪和大约克猪均无多态。杜洛克猪和陆川猪χ~2值分别为0.8098(P＞0.05)和0.0769(P＞0.05),差异显著,说明杜洛克猪和陆川猪群体在该位点上处于Hardy-Weinberg平衡状态,其它猪群在该位点均偏离平衡状态。