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厚荚相思组织培养与农杆菌介导遗传转化研究

秦欣  
【摘要】: 本论文主要对厚荚相思进行了组织培养体系的优化、遗传转化受体系统的建立以及农杆菌介导的遗传转化体系的建立进行了研究。主要试验结果如下: 1、通过正交设计和系列试验及方差分析,优化了厚荚相思组织培养的体系。试验结果表明:厚荚相思种子用98%浓硫酸处理30min和沸水浴处理10min,后用75%酒精处理30s和0.1%升汞处理10min灭菌,接种时采用胚芽向下的方式接种,用1/2MS培养基进行培养,萌发率可达69%。在初代培养中采用MS+6-BA 2.0mg/L+KT 1.0mg/L+NAA 0.1mg/L为培养基配方;第一次继代培养中采用MS+6-BA 1.0mg/L+KT 1.0mg/L+NAA0.1mg/L为培养基配方;第二次继代培养中采用MS+6-BA 1.5mg/L+KT1.5mg/L+NAA 0.5mg/L为培养基配方;生根培养中采用MS+IBA1.0mg/L+NAA 1.0mg/L+IAA 1.0mg/L为培养基配方;壮苗培养中采用MS+KT 0.6mg/L+NAA 0.1mg/L为培养基配方。移栽时采用黄泥和育苗介质(1:1)为基质。 2、通过激素组合试验和抗生素筛选试验,建立了厚荚相思遗传转化的受体系统。试验结果表明:6-BA和IBA配合使用诱导不定芽的效果比6-BA单独使用和6-BA分别与NAA、IAA配合使用的效果要好,其最佳使用浓度组合为6-BA 1.5mg/L、IBA 0.5mg/L,叶盘的分化率达到了62%。厚荚相思叶片再生的卡那霉素选择压力为50mg/L,生根选择压为150mg/L。头孢霉素的使用对叶盘分化影响不大,而硫酸链霉素和氨苄青霉素的使用对叶盘分化有较大影响。因此,确定头孢霉素为主要的抑菌抗生素,使用浓度为100~200mg/L。 3、通过对根癌农杆菌不同菌株、菌液浓度、浸染时间、预(共)培养时间及筛选培养基的比较试验,建立了农杆菌介导GUS基因的厚荚相思遗传转化体系。试验结果表明:采用预(暗)培养5d,浸染所用根癌农杆菌菌株为At06,菌液浓度为OD_(600)值取0.5,浸染时间10min,共培养3d,共培养培养基中添加AS 50mg/L,蔗糖30g/L,pH值5.8,在共培养3d后转入筛选培养基这个方法对厚荚相思进行遗传转化。在筛选培养基上培养5d后取出外植体进行GUS基因瞬时表达率的检测,发现瞬时表达率较高,达到了92%。在经过初次筛选培养,芽伸长培养(二次筛选),生根培养(三次筛选)后,从200个外植体当中得到了卡那霉素抗性植株4株。


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