收藏本站
收藏 | 论文排版

苯丙氨酸解氨酶菌株的选育及其全长cDNA序列的克隆

苏艳  
【摘要】: L-苯丙氨酸是具有生理活性的芳香族氨基酸,是人和动物不能自身合成的必需氨基酸之一,广泛应用于制药、食品等多个领域。L-苯丙氨酸是合成一些抗癌药物的中间体,以它为载体,可以把抗肿瘤药物的分子或基团载入肿瘤区,达到既能抑制肿瘤生长又能降低原肿瘤药物毒性的目的。L-苯丙氨酸还可抑制心肌成纤细胞的增生,为防治高血压提供新的方法。研究证明L-苯丙氨酸在抗肿瘤、抗癌等方面有显著作用,具有广阔的发展前景。L-苯丙氨酸最主要的用途是作为食品添加剂阿斯巴甜合成的原料。阿斯巴甜是由苯丙氨酸和天门冬氨酸合成的,甜度为蔗糖的200倍,热量是等量蔗糖的1/200。阿斯巴甜广泛应用于食品和医药工业。人们食用后,阿斯巴甜由人体的酶分解转化为氨基酸,被人体吸收后,对人体有营养保健功能。另外,人们食用阿斯巴甜,其残留部分不会转化为乳酸,因此,对人们的牙齿没有腐蚀作用。对预防龋齿病,特别是对儿童的健康有益。还有一重要有点,阿斯巴甜适合糖尿病人食用,因它不需胰岛素介入分解,不会增加血糖。总之,阿斯巴甜适用于糖尿病、高血压、心脏病、肥胖症患者。 苯丙氨酸解氨酶(PAL)是通过转氨作用合成L-苯丙氨酸,它不但作为工具酶用L-苯丙氨酸的制备,而且本身具有一定的药用价值,用于治疗实验鼠的某些肿瘤,进行血清L-苯丙氨酸的定量酶法分析,苯丙酮尿症的诊断和治疗时效果明显。研究表明PAL在抑制某些肿瘤细胞效果显著。PAL可迅速抑制癌变细胞DNA和蛋白质的合成及细胞的分裂和生长,对正常细胞影响不大。机理可能是PAL降解L-苯丙氨酸从而降低肿瘤细胞生长所必需的氨基酸,使肿瘤细胞因“饥饿”而停止生长,达到抑制肿瘤生长的目的。现临床上用脂质体包被PAL,可提高酶的催化效率,延长半衰期,降低免疫原性,达到更理想的治疗效果。 PAL广泛分布在高等植物、真菌、酵母菌和唯一的原核生物-链霉菌中。然而,在动物中尚未发现有该酶存在。PAL在高等植物内,是次生代谢的关键酶和限速酶,在植物防御方面起着重要作用。在微生物体内,PAL使得微生物可以利用L-苯丙氨酸做为唯一碳源。PAL在酵母菌尤其是红酵母家族含量最为丰富。本文选择Rhodosporidiumpaludigenum作为研究材料,对其形态特征、生理生化特征、核糖体转录间隔区(intergenicspacer region,ITS)序列分析,不同物质对产PAL的影响以及诱变育种作了研究。并且对菌株JM432产PAL基因的全长cDNA序列进行克隆。 在形态特征和生理生化特征分类的基础上,通过分子生物学方法对PAL产生菌JM432进行了分类鉴定。菌株形态、培养特征,部分生理生化反应研究表明菌株JM432具有红色酵母的形态特点,不发酵任何糖,无合成类淀粉化合物的能力,利用硝酸钾迅速而强烈。测定和分析了菌株的18S-26S rRNA ITS序列。研究结果表明,菌株JM432为红冬孢酵母属中的Rhodosporidium paludigenum。 通过单因素实验,研究了L-苯丙氨酸、L-异亮氨酸、L-酪氨酸,铵根离子,无机盐,微量元素对PAL活力的影响。结果表明,在培养基中添加诱导物对PAL的影响不大,当L-苯丙氨酸浓度为0.1%时,PAL活力仅为对照的123.04%;L-异亮氨酸浓度为0.1%时,PAL的活力为对照的121.25%;L-酪氨酸抑制PAL的合成;无机盐-铁离子对PAL有激活作用,酶活力达到对照的192.17%;在培养基中添加0.1%的硫酸铵,PAL活力为对照的258.56%;微量元素-铜离子对PAL的影响最大,酶活力为对照的384.56%。 以JM432作为实验出发菌株:制备菌悬液,加入8-MOP(甲氧基补骨质素,methoxy-psoralen)黑暗中放置30分钟。8-MOP是一种光敏试剂,8-MOP与长波紫外线复合可以产生诱变效应,常用于治疗某些皮肤病。将8-MOP应用于PAL的突变株筛选目前尚未有报道。紫外灯下照射诱变,红光下涂布筛选平板。本研究采用的筛选方法是类似物筛选系统。L-苯丙氨酸是PAL的作用底物,可以诱导酶的合成。L-酪氨酸是L-苯丙氨酸的结构类似物,是PAL的不良底物,即Km值较高。酵母菌要在这种结构类似物存在时较好地生长,只能合成更多的PAL。通过类似物筛选系统,获得了大量的突变株,进而从中筛选到PAL活力提高90%以上,遗传稳定性良好的高产菌株ZW115。同时筛选到一株37℃下生长良好,PAL活力提高二倍(与相同培养条件下的出发菌株相比较),遗传稳定性良好的高产菌株NR128。对突变株ZW115,NR128每日PAL活力进行了研究,其中ZW115和NR128的酶活峰均出现在72小时,PAL活力分别是原始菌株的0.94倍,2.23倍。 尽管对酵母产PAL的分子生物学研究取得了一些进展,一些酵母完整的PAL基因已经获得并测序,但是有关Rhodosporidium paludigenum的完整cDNA序列目前尚不清楚。为了获得PAL基因的全长cDNA序列,本研究根据Genbank上的红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)PAL蛋白,胶红酵母(Rhodotorula mucilaginosa)PAL蛋白,粘红酵母(Rhodotorula glutinis)PAL蛋白的氨基酸序列同源比对结果,选取同源性比较高的区段设计简并引物,优化设计了一对简并引物。在设计简并引物时,选择同源性相对较低而不是最高的氨基酸序列,另外采用次黄嘌呤核苷酸代替简并引物中的N,使其简并度降低到96/64,两者的退火温度更加接近。在实验中采用热启动和逐渐升温PCR技术,成功地扩增出一条650bp的cDNA片段。 为了取得JM432 PAL cDNA基因的3′端序列,采用RACE-PCR技术,根据上述已取得的中间序列设计合成一条基因特异性引物,反转录反应中采用oligo-d(T)接头引物合成第一链cDNA,扩增反应中用基因特异性引物和通用接头引物进行扩增。通过3′RACE-PCR技术延伸了PAL基因的cDNA序列,获得650bp的3′端序列。 在5′端序列的克隆中,同样根据已取得的中间序列设计两对基因特异性引物A1、S1,A2、S2以及末端磷酸化的反转录引物。用末端磷酸化的反转录引物在反转录酶(reverse transeriptase,RT)作用下反转录总RNA得到第一链cDNA,然后使用RNase H分解Hybrid DNA-RNA中的RNA链,用T4 RNA连接酶将单链cDNA环化形成首尾连接物。进行PCR扩增时,第一轮扩增用基因特异性引物A1和S1,第二轮扩增采用巢式PCR,以第一轮PCR产物为模板,利用基因特异性引物A2和S2扩增出未知mRNA的5′端。通过5′RACE-PCR技术延伸了PAL基因的cDNA序列,获得了大约1800bp的5′端序列。 将RACE-PCR技术获得的PAL基因的3′端序列和5′端序列进行拼接,得到2.3kb的JM432 PAL全长cDNA序列。根据此序列设计一对引物,采用LD-PCR技术扩增PAL全长cDNA序列。初步验证所得序列即为JM432所产PAL全长cDNA序列。


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前20条
1 王敬文,薛应龙;植物苯丙氨酸解氨酶的研究——Ⅱ 苯丙氨酸解氨酶在抗马铃薯晚疫病中的作用[J];植物生理与分子生物学学报;1982年01期
2 陈星;王璞;姚滢秋;肖白;;从基因工程乳酸菌中高效提取苯丙氨酸解氨酶的方法研究[J];生物技术通报;2008年03期
3 贺立红;张进标;宾金华;;苯丙氨酸解氨酶的研究进展[J];食品科技;2006年07期
4 赵荣乐;;黄瓜花叶病毒感染引起甜瓜植株苯丙氨酸解氨酶和叶绿素的变化[J];吉首大学学报(自然科学版);2006年03期
5 江柯,卢涛,赵德立,夏凯,杨亚力,杨顺楷,刘成君;红酵母苯丙氨酸解氨酶的分离纯化及性质研究[J];四川大学学报(自然科学版);2004年04期
6 张淑文;高帆;秦小波;徐莺;陈放;;麻疯树苯丙氨酸解氨酶启动子的克隆和表达载体的构建[J];植物研究;2007年04期
7 李进步;方丽平;张亚楠;杨卫娟;郭庆;李雷;毕彩丽;杨荣志;;棉花抗蚜性与苯丙氨酸解氨酶活性的关系[J];昆虫知识;2008年03期
8 孙红梅;赵爽;王春夏;陈丽静;王锦霞;;百合鳞茎苯丙氨酸解氨酶提取条件的优化[J];植物研究;2008年05期
9 刘建成;陈杰;苏建宇;;重组大肠杆菌产苯丙氨酸解氨酶(PAL)发酵条件研究[J];中国食品工业;2009年04期
10 赵艳霞;缪康杰;张梅梅;郑维发;;真菌激发子对桦褐孔菌多酚积累的影响[J];菌物学报;2010年03期
11 冯容保;;氨基酸发酵近年来的进展[J];发酵科技通讯;1990年04期
12 薛应龙,欧阳光察,应初衍,迟小愿;水稻、大麦幼苗胚乳中的苯丙氨酸解氨酶调节因子(PAL-R)[J];植物生理与分子生物学学报;1992年01期
13 缪元颖;刘成君;杨顺楷;杨亚力;;粘红酵母(Rhodotorula glutinis CIBAS A1401)苯丙氨酸解氨酶cDNA核心序列的克隆与分析[J];应用与环境生物学报;2005年06期
14 王燕;许锋;杜何为;蔡荣;陈柳吉;程水源;;夹竹桃苯丙氨酸解氨酶的基因克隆与序列分析(英文)[J];华北农学报;2007年04期
15 崔建东;李艳;张亚楠;;重组大肠杆菌苯丙氨酸解氨酶稳定性研究[J];精细化工;2008年10期
16 薛应龙,欧阳光察,澳绍根;植物苯丙氨酸解氨酶的研究——Ⅳ、水稻幼苗中PAL活性的动态变化[J];植物生理与分子生物学学报;1983年03期
17 江力;袁怀波;张世杰;江汉湖;;山药苯丙氨酸解氨酶特性的研究[J];食品科学;2006年10期
18 许锋;陈柳吉;蔡荣;杜何为;程水源;;海桐花苯丙氨酸解氨酶的基因克隆与序列分析[J];西北农业学报;2008年02期
19 陈小文;董学会;段留生;;赤霉素和烯效唑对东北红豆杉紫杉醇代谢的影响[J];西北植物学报;2008年10期
20 高雪;;植物苯丙氨酸解氨酶研究进展[J];现代农业科技;2009年01期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 卢同;谢世勇;李本金;种藏文;林时迟;;不同抗性的甘薯品种对苯丙氨酸解氨酶、过氧化物酶的反应[A];2003’华东植物病理学术研讨会暨江苏省植物病理学会第十次会员代表大会论文集[C];2003年
2 罗世翊;林丽芹;卢英华;;液芯CMC-ALG微胶囊固定化生产L-苯丙氨酸[A];第三届全国化学工程与生物化工年会论文摘要集(上)[C];2006年
3 杨顺楷;;对我国L-苯丙氨酸产业化发展的一些看法[A];第九届西南三省一市生物化学与分子生物学学术交流会论文集[C];2008年
4 蒋细良;王劲波;朱昌雄;王慧敏;;中生菌素对水稻防卫基因苯丙氨酸解氨酶基因转录表达的影响[A];新世纪(首届)全国绿色环保农药技术论坛暨产品展示会论文集[C];2002年
5 李红;李玲;;蝴蝶兰叶片外植体褐变过程中苯丙氨酸解氨酶研究[A];中国植物生理学会第九次全国会议论文摘要汇编[C];2004年
6 缪元颖;庄艳;杨顺楷;刘成君;;红酵母苯丙氨酸解氨酶基因cDNA的克隆[A];首届中国青年学者微生物遗传学学术研讨会论文摘要集[C];2002年
7 王旭日;范燕萍;张伟;徐婧;余让才;;几种不同花色姜花花瓣呈色机制的初步研究[A];2007年中国园艺学会观赏园艺专业委员会年会论文集[C];2007年
8 王海平;李景欣;李心文;;胡麻不同抗性材料接种尖孢镰刀菌病菌后几种酶的变化[A];’2003中国作物学会学术年会文集[C];2003年
9 郭桢;胡小平;杨之为;李振岐;;弱毒菌株尤Ⅱ对小麦条锈病的诱导抗性 Ⅱ.诱导抗性的病生理变化观察[A];中国植物病理学第七届青年学术讨论会论文集[C];2005年
10 陈晓婷;陈芳芳;陈立群;鲁国东;王宗华;;拟南芥草酸突变体的筛选与鉴定[A];中国植物病理学会2006年学术年会论文集[C];2006年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 周真;苯丙氨酸解氨酶传感器及检测系统研究[D];哈尔滨理工大学;2005年
2 蒋细良;中生菌素对水稻主要防御酶的系统诱导[D];中国农业大学;2005年
3 苏艳;苯丙氨酸解氨酶菌株的选育及其全长cDNA序列的克隆[D];广西大学;2008年
4 常金华;高粱品种“河农16”抗蚜的理化特性及抗性基因定位[D];河北农业大学;2005年
5 许锋;银杏GbPAL和GbANS基因的克隆与表达及ALA对类黄酮含量的影响[D];山东农业大学;2008年
6 邱枫;柠条锦鸡儿苯丙氨酸解氨酶(PAL)基因的克隆、RNAi载体构建和相关功能分析[D];中国农业科学院;2006年
7 张静妮;不同秋眠等级苜蓿匍柄霉叶斑病抗性评价及抗病机理研究[D];北京林业大学;2008年
8 刘金花;环境因子对黄芩植株代谢的影响[D];山东中医药大学;2011年
9 宋福南;白桦木质素合成苯丙氨酸途径相关酶基因的表达和功能分析[D];东北林业大学;2009年
10 孙敬国;烤烟品质对肥料的响应及醇化质量的调控研究[D];华中农业大学;2010年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 熊彬;利用苯丙氨酸解氨酶转化反式肉桂酸生产L-苯丙氨酸的研究[D];广西大学;2005年
2 张乐伟;桑树苯丙氨酸解氨酶基因的克隆及生物信息学分析[D];山东农业大学;2009年
3 裴熙祥;紫茎泽兰cDNA文库的构建及苯丙氨酸解氨酶(PAL)基因家族的研究[D];中国农业科学院;2009年
4 侯文婷;产苯丙氨酸解氨酶菌株筛选、重组菌构建及发酵工艺研究[D];江南大学;2012年
5 姜红林;甘蓝型油菜苯丙氨酸解氨酶及其抑制因子的研究[D];西南大学;2006年
6 宋婕;丹参苯丙氨酸解氨酶基因(SmPAL1)的克隆及其功能初探[D];陕西师范大学;2007年
7 梁伟红;杨盘二孢菌激发子的研究[D];南京林业大学;2005年
8 夏宁;一氧化氮激发植物产生次生代谢产物异黄酮与DNA甲基化的关系研究[D];合肥工业大学;2006年
9 赵建江;番茄叶霉病菌对嘧菌酯的抗药性研究[D];河北农业大学;2008年
10 张宽朝;霍山石斛苯丙氨酸解氨酶的分离纯化、酶学特性及外界影响因素研究[D];安徽农业大学;2009年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978