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利用乙腈与质谱技术筛选鼻咽癌相关血清标志蛋白质的研究

邓开凤  
【摘要】:目的: 1、建立鼻咽癌血清蛋白质组研究中高丰度大分子蛋白质的去除和小分子蛋白质/多肽的富集方法。 2、建立乙腈处理后鼻咽癌患者与正常人血清蛋白质的表达谱,筛选鼻咽癌差异蛋白质,为获得鼻咽癌相关血清标志蛋白质提供新的方法。 3、初步分离10kDa以下的蛋白质条带,分析与鉴定可能与鼻咽癌相关的差异蛋白质。 方法: 1、应用不同倍数(1.5:1,1.2:1)的乙睛去除鼻咽癌血清中的高丰度蛋白质,通过Tricine-SDS-PAGE电泳比较高丰度蛋白质的去除和低丰度蛋白质/多肽的富集情况,选择最合适的乙腈处理倍数用于质谱分析和差异蛋白质的筛选研究。 2、SELDI-TOF-MS技术和弱阳离子蛋白质芯片(CM10)分析乙腈处理后鼻咽癌患者与正常人血清的蛋白质谱,筛选差异蛋白质,并与原始鼻咽癌患者和正常人血清之间的差异蛋白质比较,寻找相同的差异蛋白质。 3、通过Tricine-SDS-PAGE电泳,切胶分离乙腈处理的鼻咽癌患者血清中小于10kDa的小分子蛋白质/多肽,SELDI-TOF-MS确认差异蛋白质峰、MALDI-TOF-MS/MS鉴定蛋白质条带,寻找和鉴定可能与鼻咽癌相关的差异蛋白质。 结果: 1、Tricine-SDS-PAGE电泳结果显示,乙睛沉淀法能够去除鼻咽癌血清中大部分高丰度蛋白质,同时也能够富集低丰度小分子蛋白质/多肽,特别是10kDa以下的蛋白质条带清晰可见。 2、SELDI-TOF-MS技术和CM10蛋白质芯片分析乙腈处理的鼻咽癌患者血清,结果显示,蛋白质谱峰荷质比范围2000~20,000m/z、首次噪音过滤值5 S/N(Signal / Noise)、峰群出现频率15%、二次噪音过滤值2 S/N、峰值波动范围±0.3%(m/z)的标准化设定条件下,共检测到蛋白质(或多肽)峰80个,其分布落在分子量为6,000Da~10,000Da范围的占26.2%,分子量10,000Da的占37.5%,峰值强5的蛋白质峰占率13.8%;与同样经乙腈处理过的正常人血清蛋白质谱比较(P0.05且各蛋白质峰值的MeanSD)共发现13个差异蛋白质峰,其中5个表达上调(5638.8、8480.3、8579.0、8705.1、13772.8Da),8个表达下调。经比较发现,乙腈处理的鼻咽癌患者与正常人血清之间的5个表达上调的差异蛋白质中,其中4个在原始鼻咽癌患者和正常人血清之间的差异蛋白质中存在。表达下调的差异蛋白质在乙腈处理与非处理的鼻咽癌血清蛋白质谱中不尽相同。 3、经SELDI-TOF-MS确认差异蛋白峰和MALDI-TOF-MS/MS分析蛋白条带发现,其中8705.1Da的差异蛋白质峰可能是载脂蛋白C III( ApoC-III)。 结论: 1、在蛋白质谱峰荷质比范围2000~20,000m/z内,乙腈处理与原始的鼻咽癌血清蛋白质谱存在一定的差异:原始的鼻咽癌血清蛋白质峰大多集中在6,000Da以下,而6,000Da的蛋白质峰在乙腈处理的鼻咽癌血清中发现率提高,占总蛋白质峰的一半以上(26.2%+37.5%);多数表达上调的差异蛋白质在乙腈处理和原始鼻咽癌血清中同时发现,但前者峰值强度增高。 2、乙腈沉淀去除血清中高丰度大分子蛋白质和富集小分子蛋白质的方法有效,值得在血清蛋白质组学研究中应用,并有可能更简单地获得其中有意义的差异蛋白质。


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