血清CEA阴性结直肠癌患者蛋白组学比较研究

【摘要】：背景:结直肠癌是一种世界性的常见恶性肿瘤,严重威胁着人们的身心健康。因此,加强结直肠癌的生物学特性研究,深入探讨结直肠癌的发生机制,并寻求有效的早期诊断指标和治疗方法,对于提高结直肠癌的疗效和预后具有重要意义。高通量的双向电泳技术及质谱技术已广泛应用于各种肿瘤研究领域,成为研究肿瘤靶标的一种重要的手段。由于血清在临床诊断中的具有重要作用,人血清蛋白组学越来越引起各学科领域的重视,血清中的蛋白浓度与它的生理功能密切相关。目前临床应用较多的结直肠癌相关性肿瘤标志物有癌胚抗原(CEA)、CAl99和CA242等,但均存在存在敏感性与特异性不高的问题,其中CEA作为结直肠癌的标志物应用最广泛,但其敏感性较低及特异度较低,约有1/3的肠癌病人CEA在正常范围,因此,CEA并不是理想的筛查结直肠癌患者的肿瘤标记物,尤其是CEA阴性的病人。因此,新的和有效的肿瘤标志物的研究很有必要。 目的:本研究拟采用蛋白组学研究方法双向电泳(2DE)和基质辅助激光解吸离子化一串联飞行时间质谱(MALDI-TOF/TOF-MS)技术开展血清CEA阴性结直肠癌患者相关的血清蛋白质组学研究,分析鉴定血清CEA阴性结直肠癌患者和血清CEA阳性结直肠癌患者血清以及正常人血清的差异表达蛋白,以期发现在血清CEA阴性结直肠癌发生过程中起重要作用的关键蛋白质分子,有利于补充结直肠癌发生的分子机制,并可能发现一些新的相关的肿瘤标志蛋白,为结直肠癌的发生提供新的诊断手段,除此之外,一些新发现的蛋白还可能成为新的潜在的治疗靶点。 方法:血清CEA阴性结肠癌患者、血清CEA阳性结肠癌患者与正常人空腹血清标本各11例分别等量混合成3组样本,去除血清中的白蛋白和球蛋白后,利用双向凝胶电泳(2-DE)分离血清总蛋白质后,胶体考马斯亮蓝染色,经图像分析筛选差异表达的蛋白点.应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS/MS)鉴定差异表达的蛋白点,并对其部分蛋白进行生物学分析。另选新的各组各32例血清标本,用Western blot方法对其中某些差异蛋白进行表达验证。 结果:经高丰度蛋白的去除,2DE图像的优化,获得了重复性较好的双向凝胶电泳图谱,各胶上的蛋白质点同时与参考胶相匹配,对照分析发现筛选出差异≥2倍以上差异蛋白点共13个,进行MALDI-TOF-MS分析:鉴定出1)血清CEA阴性结肠癌患者与正常人血清比较,表达下调的蛋白有纤维胶凝蛋白2前体,纤维胶凝蛋白3,载脂蛋白L1,间a胰蛋白酶抑制剂轻链H4,转甲状腺素蛋白,表达上调的蛋白为免疫球蛋白lambda轻链,2)血清CEA阳性结肠癌患者与正常人血清比较,表达下调的蛋白有纤维胶凝蛋白2前体,纤维胶凝蛋白3,载脂蛋白L1,间a胰蛋白酶抑制剂轻链H4,转甲状腺素蛋白,表达上调的蛋白为:载脂蛋白E,结合珠蛋白。3)血清CEA阴性结肠癌患者与血清CEA阳性结肠癌患者的1个差异点,经鉴定为免疫球蛋白lambda轻链,并且讨论和推测了这些蛋白的功能和抑制肿瘤增殖的机制。4)经Western blot验证显示:与正常人相比:载脂蛋白L1在血清CEA阴性及阳性的结肠癌患者中均低表达,结合珠蛋白在在血清CEA阴性及阳性的结肠癌患者中均较正常人高表达。 结论:利用血清蛋白质组学方法,建立分辨率高和重复性好的结直肠癌血清蛋白质的双向凝胶电泳图谱,从而在血清CEA阴性肠癌患者、血清CEA阳性肠癌患者及正常人血清中寻找了一些差异蛋白,探讨其生物功能,找到的一些差异蛋白,载脂蛋白L1及结合珠蛋白可能作为结直肠癌的一个潜在肿瘤标志物。