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持续性心房颤动患者心房2型小电导钙激活钾通道变化的研究

徐先增  
【摘要】:1背景和目的 心房颤动(atrial fibrillation,AF)是临床上最常见的心律失常,见于各种器质性心脏病,我国通常并发于风湿性心脏瓣膜病(rheumatic heart disease,RHD),特别是二尖瓣病变。部分患者则无明确病因。AF发生后可导致心功能进一步受损,卒中发病率上升,病死率成倍增加。 AF的预防和治疗均不理想,原因是AF的发生和维持机制尚不完全明了。AF发生后心房组织可发生一系列的结构和功能改变,致使AF易于复发和维持,发生心房重构,其中电生理方面表现为动作电位和有效不应期时程的缩短,频率适应性降低,即所谓的电重构。电重构使得房内多子波折返更易于维持,而不易终止。电重构牵涉到一系列的离子通道的改变,各种离子通道在电重构中所起的作用也成为近年来研究的热点,其中那些心房表达多于心室的离子通道有可能成为预防和治疗AF的潜在理想靶点。钙激活钾通道分布非常广泛,被细胞内微量钙离子(1.0μM)激活,按电导大小可以分为大电导(big conductance,BK)、中电导(intermediate conductance,IK)和小电导(small conductance ,SK)三种类型,SK2则属于SK的一种亚型,α亚基是通道的功能亚基,为KCNN2基因所编码;钙调蛋白(calmodulin,CaM)是通道的辅助亚基。SK2可被极低浓度(100 pM~10 nM)的蜂毒明肽(apamin)特异性阻断。研究证明心房的SK2表达明显多于心室,短时间快速刺激肺静脉即可见SK2表达增加,蛋白膜向转移增强,全细胞水平电流密度加大,并且这些变化与动作电位的缩短关系明显,因此被认为可能是治疗AF的另一个理想靶点。近期的一个动物实验证明,应用SK2阻断剂能够预防和终止AF的发作。但以上研究均为模拟短期AF的动物实验,在人类患持续性AF后SK2的结构和功能的改变尚不为人知晓。本研究主要涉及心房与心室之间、左右心房之间SK2基因与蛋白表达量的差别。并探讨在人类患持续性AF后SK2各亚基的基因蛋白表达水平和SK2功能水平的改变,以及这一改变在电重构所起的作用,为寻找防治持续性AF的可能理想靶点提供理论依据。 2内容和方法 2.1 SK2在心脏各部位的分布特性 2.1.1选择RHD行二尖瓣置换术的患者,在体外循环前取左右心耳组织,并分成两份用于免疫组织化学(immunohistochemistry,IHC)和逆转录聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR),检测SK2基因和蛋白的表达水平。 2.1.2选择先天性心脏病(congenital heart disease,CHD)存在右心室流出道肥厚并行畸形矫正术的患者,在体外循环前取右房耳组织,术中取右室流出道组织,每份标本分成两份用于IHC和RT-PCR,检测SK2基因和蛋白的表达水平。 2.1.3应用Langendoff灌流装置急性分离获得SD大鼠的心房和心室肌细胞,应用全细胞模式记录Ca~(2+)激活K+电流(Ik,ca),也被称为apamin敏感性K+电流。 2.2人患持续性AF后SK2的改变 2.2.1选择RHD行二尖瓣置换术的患者,分为是否存在持续性AF(持续时间大于7天)分为AF和窦性心律(normal sinus rhythm,NSR)两组。在体外循环前取右心耳组织,进行常规HE染色和Masson染色,观察细胞、细胞外基质等一系列心房结构重构的变化,并通过RT-PCR和IHC,检测SK2α亚单位和辅助亚单位基因蛋白的表达水平。 2.2.2选择行二尖瓣置换术的RHD的患者,分为是否存在持续性AF分为AF和NSR两组,在体外循环前同时取右心耳组织,两步酶解法急性分离获得心房肌细胞,应用全细胞模式,记录apamin敏感性K+电流的电流密度。 2.2.3应用Langendoff心脏灌流系统可以获得约50%的结构功能良好且耐钙的心肌细胞。结构功能良好的心肌细胞胞膜完整,折光性强,有明显的横纹,可用于膜片钳实验。 3结果 3.1 SK2的心脏各部位分布 3.1.1左右心房对照 合并持续性AF的RHD患者8例, SK2通道在左右心房组织的基因与蛋白表达均未见差别。 3.1.2心房心室对照 6例先天性心脏病患者,法洛氏四联症(tetralogy of Fallot,TOF)3例,室间隔缺损(ventricular septal defect ,VSD)2例,肺动脉瓣狭窄(pulmonary stenosis,PS)1例,全部为NSR。KCNN2基因相对表达量在人心房和心室间无差别,但SK2蛋白表达量心房比心室明显增加。 3.1.3 SD大鼠心房心室肌细胞Ik,ca电流的比较 应用数字相减方法可记录到大鼠心房和心室肌细胞的Ik,ca。Ik,ca呈内向整流特性,对apamin敏感,翻转电位-60mV,接近Nernst方程。心房心室肌细胞均可记录到Ik,ca。脉冲电压为-50~40mV时,心房肌细胞Ik,ca电流密度显著大于心室肌细胞;脉冲电压为-90~-40mV时,心房心室肌细胞Ik,ca电流密度无差别。心房肌细胞和心室肌细胞的膜电容测定值分别为48.25±4.15pF和21.36±3.23pF,差异有统计学意义。 3.2人类持续性AF后SK2的改变 3.2.1两组患者基线资料 与NSR患者相比,持续性AF患者二尖瓣狭窄(mitral stenosis,MS)比例更大,左心房内径以及心胸比率增加更显著,P0.05。持续性AF患者年龄偏大,肺动脉收缩压偏高,但与NSR患者比较,差别未达到统计学意义。在男女性别比例、左心室舒张径、左室收缩径、心功能NYHA分级等方面,持续性AF患者与NSR患者差别不大。 3.2.2HE染色和Masson染色 心房肌细胞纵向呈现条杆状,横向呈现类圆形,内有肌丝,细胞核多为一个,位于细胞中央,多个细胞呈密集束状排列,有分支相连。持续性AF患者的心房肌细胞增大,排列紊乱,持续性AF患者的心房组织内胶原组织增生明显增加。 3.2.3 AF组SK2α亚单位基因和蛋白表达的变化 AF和NSR两组患者KCNN2基因相对表达量分别为0.70±0.30和1.25±0.52,差别有显著统计学意义(P0.01)。AF组SK2蛋白表达减少,IOD分别为2 525 900±772 807.4和2 206 917±1 170 312,下调幅度13%,但未达到统计学意义(P0.05),细胞内分布特点变化不明显。 3.2.4 AF组SK2辅助亚单位钙调蛋白(calmodulin,CaM)基因和蛋白表达的变化 持续性AF发生后心房组织的CaM mRNA水平无明显变化。CaM蛋白的阳性表达呈棕黄色,主要在心房肌细胞的胞膜上分布,呈相对浓然的环状;胞浆也有少量分布,表达主要在核周;胞核内无分布。分布特点与SK2蛋白呈现重叠性。持续性AF组与NSR组CaM蛋白表达差别未达到统计学意义。 3.2.5持续性AF患者心房肌细胞Ik,ca电流的变化 AF患者与NSR患者比较心房肌细胞动作电位时程显著缩短。应用数字相减方法可获得NSR和持续性AF患者心房肌细胞的apamin敏感性K~+电流,即Ik,ca。总体来讲,与NSR患者相比,持续性AF患者心房肌细胞均Ik,ca电流密度上调,在脉冲电压在-10~+40mV时,差别达到显著统计学意义。持续性AF患者心房肌细胞的膜电容显著增大。 4讨论 研究离子通道一般从基因、蛋白以及功能等方面入手,研究方法多种多样,而较为经典的实验方法包括RT-PCR,IHC和膜片钳3种。我们在实验中,正是通过RT-PCR,IHC和膜片钳3种经典实验方法对持续性AF后SK2的变化进行研究。为探讨SK2在心脏各部位分布的差异性,发现左右心房间SK2的基因和蛋白表达均不存在差异,右心耳组织SK2表达的变化亦可反映左心房的变化。另外还发现心室组织比较心房组织基因表达不减少,但蛋白表达明显减少,这一结果和以往的动物实验结果不一致,说明在人的心室组织中SK2表达可能存在某种目前尚不明了的翻译后调节机制。以SD大鼠心房心室肌细胞为实验对象,发现心房肌细胞的Ik,ca的电流密度显著大于心室肌细胞,这一结果提示应用SK2通道特异性阻断剂治疗房性心律失常,可以主要影响心房肌细胞的电生理特性,而对心室肌细胞的电生理特性影响很小,因此SK2通道将来可作为防治房性心律失常的的理想靶点。 采集RHD二尖瓣病变患者的右心耳组织,并从基因、蛋白、功能多个层面应用经典实验方法第一次探究人类持续性AF发生后SK2通道的变化。本组RHD二尖瓣病变行二尖瓣置换术(mitral valve replacement,MVR)时病情均较重,均为持续性AF,因此未再另列一组,而仅以持续性AF与NSR患者进行比较。与NSR患者相比,持续性AF组更多为MS患者,左心房增大更明显。MS患者的心房重构的特征既是左心房增大,增大的心房可为多个折返的存在提供足够的空间,利于AF的维持。除左心房增大外,HE和Masson染色的病理结果还发现,持续性AF组心房胶原组织增生严重,心肌细胞排列紊乱。目前认为胶原组织增生严重导致心房间质纤维化是AF基质的重要组成部分,间质纤维化可打乱心肌细胞规则的排列顺序,使细胞间电信号传导减慢,有利于折返的维持。 检测NSR和AF两组患者右心耳组织的mRNA水平,发现两组患者心房组织SK2α亚单位基因KCNN2均有表达,但与既往动物实验中短期刺激心房模仿阵发性AF的结果不同,本实验发现持续性AF患者心房组织的KCNN2 mRNA水平下调。另外,NSR与持续性AF患者右心房肌细胞SK2蛋白均呈现阳性表达,其蛋白分布主要在细胞膜。两组患者心房肌细胞的SK2分布特点为一致,持续性AF患者SK2通道蛋白表达偏低,这与此前的动物实验结果也不相同。 NSR和持续性AF两组患者右心耳组织均有CaM基因表达,但持续性AF发生后右心耳组织的CaM mRNA水平未改变。NSR与持续性AF患者右心房肌细胞CaM蛋白均呈现也都呈阳性表达,两组患者心房肌细胞的CaM分布特点为一致,蛋白表达量也未见有变化。以上结果说明,持续性AF未对CaM的基因和蛋白表达造成影响,其表达水平与持续性AF apamin敏感性K~+电流密度上调无关。 应用apamin前后电流相减可记录到单纯apamin敏感性电流,持续性AF患者心房肌细胞上的apamin敏感性电流密度更大。通道电流的密度可能受很多因素影响,其中一个重要因素是通道基因蛋白表达水平,持续性AF患者KCNN2表达下调,一般情况下可以导致apamin敏感性电流密度下调。但由于AF发生后,心房肌细胞胞内Ca~(2+)显著超负荷,胞内Ca~(2+)增加可以使SK2功能水平上调,因此可以认为此时胞内Ca~(2+)增加对于SK2功能水平的影响超过了SK2基因和蛋白表达下调带来的影响。 5结论 综上所述,右心房SK2基因蛋白表达的水平可以反映左心房SK2基因蛋白表达的水平。SK2通道心房心室间基因表达无差异,但心房SK2通道蛋白表达以及apamin敏感性K~+电流均较心室增强。与以往动物实验不同,人类持续性AF后,SK2通道α亚单位基因蛋白表达下调,辅助亚单位CaM的基因和蛋白表达未发生变化,但功能水平水平显著上调。apamin敏感性电流密度在除受基因蛋白表达水平影响外,主要受心房肌细胞内Ca~(2+)水平超负荷影响。SK2通道可以作为治疗人持续性AF的理想靶点,SK2通道阻断剂作为新一代抗心律失常药物治疗心房颤动的效果值得期待。


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