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新生期树鼩感染人乙型肝炎病毒模型的优化

王琦  
【摘要】:目的:通过探索和比较不同的感染源、接种方式、检测方法和其它辅助措施的感染效果,进一步优化新生期树鼩感染HBV模型。 方法:第一部分.优化感染源,制备的多种感染源主要包括:1.乙肝患者单份血清或多份混合血清;2.已证实感染了HBV的树鼩血清;3.分泌HBV颗粒的HepG2.2.15细胞培养液上清;4.含HBV基因组的质粒pT-HBV1.3;5.经过纯化的乙肝患者血清。第二部分.优选接种方式,主要的接种方式包括:1.单纯皮下注射;2.单纯腹腔注射;3.皮下+腹腔注射;4.静脉+腹腔注射;5.经皮直接肝注射;6.剖腹经脾脏肝注射。第三部分.优选适合检测树鼩体内HBV感染标志的方法,主要包括:1.应用FQ-PCR检测血清和肝组织HBV DNA;2.应用ELISA定性检测血清样品的HBV免疫学标志(乙肝两对半);3.应用TRFIA定量检测血清样品HBsAg;4.应用Dot blot方法检测肝组织的HBV DNA;5.用电子显微镜观察血清和肝组织的HBV颗粒;6.用免疫组化方法检测肝组织的HBsAg和HBcAg;7.用光学显微镜观察肝组织病理变化。第四部分.探索提高感染效率的其它辅助措施,主要包括:1.用已证实感染了HBV的母树鼩进行繁殖生产;2.对妊娠后期的母树鼩接种HBV感染血清;3.免疫抑制剂应用于树鼩接种HBV期间;4.比较新生期(出生1周内)和非新生期(出生1周~1年)树鼩接种HBV的感染效果。 结果:第一部分.在多种感染源中,乙肝患者单份血清和已证实感染HBV的树鼩血清显示出较佳感染效果:至目前6只已证实持续感染68周以上的树鼩中,5只以单人血清(纯化或未经纯化)接种,1只以已证实感染HBV的树鼩血清接种;以其它感染源接种的树鼩均未获得明确的持续感染效果。第二部分.以上6只长期携带HBV的树鼩中,4只为单纯皮下注射接种,2只为皮下+腹腔注射接种;以其它方式接种的动物均未获得明确的持续感染。第三部分.1.FQ-PCR检测结果显示,6只持续感染的树鼩血清HBV DNA拷贝数在接种第12~30周后持续为103~104/ml,肝组织HBV DNA拷贝数大都在接种后第12周显示为104~106/μg肝组织总DNA,以后逐步升高并保持在107~108/μg肝组织总DNA。2.ELISA和TRFIA检测结果显示持续感染的6只动物中,4只接种后的多次血清标本均呈HBsAg阳性并保持在较高水平,另2只显示间断弱阳性。3.Dot blot所测4只持续感染动物的肝组织HBV DNA,结果均为阳性。4.电镜观察3只持续感染动物标本的结果显示,血清均可观察到直径接近40nm的大球形颗粒即Dane颗粒,还可见小球形颗粒和杆状颗粒;其中2只的肝组织可见到细胞核内HBV早期复制颗粒和细胞浆内晶格状排列的HBV颗粒。5.免疫组化结果显示,所测3只持续感染动物的肝组织内均可见HBsAg和HBcAg阳性的肝细胞。6.光镜下树鼩肝组织病理改变轻微,可见炎细胞浸润、肝细胞轻度增生和水肿。第四部分.1.长期携带HBV的母树鼩所产4仔均夭折,肝组织内未查到明确的HBV感染证据。2.妊娠后期接种HBV感染血清的母树鼩所产的仔树鼩,部分于接种后6或12周肝组织HBV DNA拷贝数处于中等水平(103~105/μg肝组织总DNA),血清HBsAg呈低水平,但至接种后48周未见明确的持续感染者。3.新生期接种HBV并同时用免疫抑制剂(CsA)的树鼩,在接种后12周时血清和肝组织HBV DNA拷贝数为阴性~104,2只动物血清HBsAg呈弱阳性;成年期接种同时用免疫抑制剂的树鼩,血清中仍较早出现HBsAb并且未出现其它HBV感染标志,少数动物肝组织HBV DNA拷贝数为103~104。4.本课题获得的6只(6/77,7.79%)持续感染HBV动 物全部为出生后3日龄内接种;因某些操作的需要本课题接种了非新生期动物共49只,无一显示明确感染。 结论:1.HBV单人血清和已证实感染了HBV的树鼩血清是感染新生树鼩的较佳感染源;2.单纯皮下注射和皮下+腹腔注射是新生期树鼩的较好接种方式;3.用于检测人血清样品HBV DNA的FQ-PCR试剂和方法以及用于检测人血清样品HBV免疫学标志的ELISA/TRFIA试剂和方法适用于检测树鼩标本,结果稳定;Dot blot、电子显微镜观察和免疫组化染色适用于树鼩感染HBV的最后验证;4.用已证实感染HBV的树鼩血清接种新生期树鼩和新生树鼩在接种HBV期间应用免疫抑制剂等措施,能减少接种后血清出现HBsAb,因此可能有助于提高HBV对树鼩的感染效果。


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