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金黄扶正散对免疫抑制小鼠的免疫调节作用及机制研究

朱丹  
【摘要】:目的 为了探讨金黄扶正散对免疫抑制小鼠的免疫调节作用,本研究通过建立免疫抑制小鼠模型,观察金黄扶正散对免疫抑制小鼠免疫器官、抗应激能力、抗自由基水平和免疫细胞功能等方面的影响,并进行作用机制研究,为其临床应用提供依据。 方法 1 SPF级昆明种小鼠60只,14-18g,随机分为六组,分别为:正常对照组(生理盐水灌胃0.2mL/10g,连续10天);环磷酰胺组(生理盐水灌胃0.2mL/10g,连续10天,同时隔天皮下注射环磷酰胺30mg/kg);阳性对照组(每天灌胃左旋咪唑剂25 mg/kg,连续10天,给药后隔天皮下注射环磷酰胺30mg/kg);金黄扶正茶高、中、低剂量组(每天分别灌胃金黄扶正茶5.08g/kg、2.54g/kg、1.27 g/kg,连续10天,给药后隔天皮下注射环磷酰胺30mg/kg),建立免疫功能低下小鼠模型。末次给药后小鼠禁食12h,处死,分别取胸腺,脾脏称重,计算胸腺、脾脏指数。将脾脏制成组织匀浆,离心,取上清,进行乳酸脱氢酶(LDH)活性测定和酸性磷酸酶(ACP)活性测定。 2造模及给药方法同1,分别进行负重游泳实验、耐高温实验、耐低温实验、常压耐缺氧实验和亚硝酸盐中毒性耐缺氧实验。游泳实验观察其游泳时间,其余各实验观察存活时间。 3造模及给药方法同1,取小鼠脾脏制成组织匀浆,离心,取上清,测定总抗氧化能力(T-AOC)、过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)和丙二醛(MDA)。 4造模及给药方法同1,采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法,测定刀豆蛋白A (ConA)诱导脾脏T淋巴细胞增殖和脂多糖(LPS)诱导B淋巴细胞增殖的影响,测定自然杀伤细胞(NK细胞)和淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK细胞)活性,检测巨噬细胞吞噬中性红能力和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的活性。 5造模及给药方法同1.1,末次用药后小鼠禁食12h,各组小鼠尾静脉取血1mL,离心,取血清备用,采用细胞因子抗体芯片进行细胞因子定量检测。 6造模及给药方法同1.1,小鼠处死后,取脾,立即置液氮中,随后转移置-80℃低温冰箱保存,采用实时荧光定量PCR (FQ-PCR)方法检测脾脏T-bet、GATA mRNA的表达。 7造模及给药方法同1.1,小鼠处死后,取脾,4%多聚甲醛固定,常规脱水,石蜡包埋,切片,采用TUNEL染色法观察细胞凋亡情况。 8采用FQ-PCR方法检测脾脏Bcl-2、Bax、Fas和FasL mRNA的表达。 结果 1与正常对照组比较,环磷酰胺组胸腺指数,脾脏指数显著降低(P0.05),给药后,金黄扶正散中、高剂量组可显著提高免疫抑制小鼠的胸腺指数、脾脏指数(P0.01,P0.05)。与正常对照组比较,环磷酰胺组可明显降低LDH、ACP的活性(P0.01);给药后,金黄扶正散低、中、高剂量组可明显提高免疫抑制小鼠的LDH活性和ACP活性(P0.01,P0.05)。 2与正常对照组比较,环磷酰胺组负重游泳时间明显减少(P0.05),耐高温存活时间明显减少(P0.01),耐低温存活时间明显减少(P0.01),在常压缺氧条件下的存活时间明显减少(P0.01),亚硝酸盐中毒性缺氧状态下存活时间明显减少(P0.01);给药后与模型组比较,金黄扶正散中、高剂量组能明显延长负重游泳时间(P0.05),金黄扶正散低、中剂量组能明显延长耐高温存活时间(P0.01),金黄扶正散低、中剂量组可显著提高小鼠的耐低温存活时间(P0.05),金黄扶正散低、高剂量组能明显延长常压耐缺氧存活时间(P0.01),金黄茶中剂量组能明显延长亚硝酸盐中毒性缺氧存活时间(P0.01)。 3与正常对照组比较,环磷酰胺组可显著降低T-AOC能力(P0.01),降低CAT、SOD、GSH-PX的活性(P0.05,P0.01);明显提高MDA含量(P0.05)。给药后,金黄扶正散中、高剂量组可明显提高免疫抑制小鼠的T-AOC能力(P0.01);金黄扶正散高剂量组可明显提高免疫抑制小鼠的CAT、SOD、GSH-PX的活性(P0.05,P0.01);金黄扶正散中、高剂量组可明显降低免疫抑制小鼠的MDA含量(P0.05,P0.01)。 4与环磷酰胺组比较,金黄扶正散低、中、高剂量组均能显著提高免疫抑制小鼠的T、B淋巴细胞增殖能力(P0.01);金黄扶正散中、高剂量组能显著提高免疫抑制小鼠NK细胞、LAK细胞活性(P0.01,P0.05);金黄扶正散高剂量组能显著性提高免疫抑制小鼠的CD3+淋巴细胞数(P0.05),金黄扶正散中、高剂量组能显著性提高免疫抑制小鼠的CD4’淋巴细胞数(P0.01),金黄扶正散低、中、高剂量组降低CD8+淋巴细胞数和提高CD4+/CD8+比值(P0.01,P0.05);金黄扶正散中、高剂量组可提高腹腔巨噬细胞吞噬能力(P0.05);金黄扶正散低、中、高剂量组可提高巨噬细胞iNOS活性(P0.01,P0.05)。 5与正常对照组比较,环磷酰胺组的2种细胞因子IFN-Y和RANTES呈显著性降低(P0.05),金黄扶正散低、中、高剂量组给药后IFN-γ有显著性提升,高剂量组的RANTES呈显著性升高(P0.05);与对照组比较,环磷酰胺组的5种细胞因子IL-5、IL-6、IL-9、IL-13和MCP-1呈显著性升高(P0.01,P0.05),给药组给药后有不同程度降低(P0.01,P0.05);13种细胞因子GM-CSF、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-10、IL-12、IL-17、M-CSF、TNF-α、KC和VEGF无明显变化(P0.05)。 6与环磷酰胺组比较,金黄扶正散低、中、高剂量组的T-bet mRNA表达量呈显著性提高而GATA mRNA表达量呈显著性降低(P0.01)。 7与正常对照组比较,环磷酰胺组凋亡指数显著性提高(P0.05);金黄扶正散中、高剂量组凋亡指数与环磷酰胺组比较显著性下降(P0.01,P0.05)。金黄扶正散低剂量凋亡指数与环磷酰胺组比较无显著差异(P0.05)。 8与环磷酰胺组比较,金黄扶正散中、高剂量组的bcl-2 mRNA表达量呈显著性提高(P0.01),bcl-2/ bax mRNA比值呈显著性降低(P0.01,P0.05)。与环磷酰胺组比较,金黄扶正散中、高剂量组的Fas和FasL mRNA表达量均呈显著性降低(P0.01,P0.05)。 结论: 1采用免疫抑制剂环磷酰胺制造免疫抑制小鼠模型,造模后小鼠胸腺指数、脾指数下降,金黄扶正散可提高免疫抑制小鼠的胸腺指数、脾脏指数,提高免疫抑制小鼠的LDH和ACP活性,激活巨噬细胞的活化状态。 2金黄扶正散可延长免疫抑制小鼠负重游泳时间,提高其耐高温、低温、常压耐缺氧、亚硝酸盐中毒性缺氧的存活时间,提高免疫抑制小鼠抗应激的能力。 3金黄扶正散可显著提高免疫抑制小鼠CAT、T-SOD、GSH-PX的活性显著提高T-AOC能力,明显降低MDA含量,调节体内抗氧化酶的水平和自由基水平,改善机体的氧化还原状态。 4金黄扶正散能显著提高免疫抑制小鼠脾脏T淋巴细胞和B淋巴细胞增殖能力;提高免疫抑制小鼠NK细胞和LAK细胞杀伤活性;提高免疫抑制小鼠外周血CD3+和CD4+/CD8+比值;提高免疫抑制小鼠腹腔巨噬细胞吞噬活性及iNOS活力,从而提高免疫抑制小鼠的细胞免疫功能。 5小鼠血清中细胞因子的变化提示,免疫抑制小鼠的Th1细胞向Th2细胞偏移,Thl/Th2亚群失衡,金黄扶正散对免疫抑制小鼠Thl/Th2亚群的调节,可能是通过提高免疫抑制小鼠脾脏T-bet mRNA的表达和降低GATA mRNA的表达来实现的。 6金黄扶正散可抑制免疫抑制小鼠脾细胞凋亡,降低凋亡指数,其机制可能是通过促进bcl-2 mRNA的表达、提高bcl-2/bax的比值,抑制Fas与FasL mRNA的表达,影响线粒体、死亡受体依赖的凋亡途径来实现的。


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