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Th17细胞在人脊柱结核中的作用机制研究

陈明  
【摘要】:第一章脊柱结核患者血液及病骨组织中Th17细胞及其表型特征 目的探讨脊柱结核患者病骨组织、外周血中是否存在Th17细胞,其相关细胞因子的变化,并探讨其数量、表型及转录因子维甲酸相关孤儿受体γt (RORyt)的表达情况。 方法收集10例行脊柱结核病灶清除、植骨减压融合内固定术配合抗结核药物治疗的患者入院时、术中及术后1周的血液标本,脊柱结核病骨及术中取自体髂骨植骨块标本。病理组织切片观察结核病骨及术中取自体骨植骨块组织形态学改变。流式细胞术及双重免疫荧光染色确定标本中存在Thl7细胞及其所占CD4+T细胞百分比,并确定其表型。酶联免疫吸附法(ELISA)检测标本中干扰素(IFN-γ)和肿瘤坏死因子(TNF-a)水平;PCR检测标本中RORytmRNA表达。 结果(1)血液标本前后对照的变化入院时IFN-y为168.7±19.2pg/L,术中IFN-γ为113.7±15.3pg/L,术后1周IFN-γ为62.7±14.9pg/L;入院时TNF-a为37.1±8.4ng/mL,术中TNF-α为32.1±5.3ng/mL,术后TNF-α为0.2±7.4ng/mL。术前与术中比较明显增高(P0.05),术中与术后比较明显增高(P0.05);(2)脊柱结核病骨及术中取自体髂骨植骨块标本对照的变化病骨组织中IFN-y为78.7±32.4Pg/L,自体髂骨植骨块中IFN-y为11.3±5.2pg/L;病骨组织中TNF-a为9.6±4.4ng/mL,自体髂骨植骨块中TNF-α为7.5±4.3ng/mL,脊柱结核病骨中明显高于自体髂骨植骨块中浓度(P0.05);(3)骨组织中与血液中IFN-y及TNF-a水平比较脊柱结核病骨组织中较入院时及术中、术后血液中浓度增高(P0.05),术中取自体髂骨植骨块中浓度较术前及术中血液中浓度减低(P0.05),与术后1周无明显差异(P0.05);(4)Th17细胞比例、RORyt和IL-17mRNA表达量改变术前血液Th17细胞占CD4+T淋巴细胞比例为0.8%±0.1%,术中为0.9%±0.2%,术后1周为0.4%±0.1%,术前与术中比较明显增高(P0.05),术中与术后比较明显增高(P0.05)。;脊柱结核病骨中Th17细胞比例为:8.2%±3.2%,自体髂骨植骨块中Th17细胞比例为:0.2%±0.1%。脊柱结核病骨中明显高于自体髂骨植骨块中浓度(P0.05)。术前血液中RORyt表达量为(23.4±3.6)ng/,结核病骨组织中RORyt表达量为(56.3±4.4)ng/,自体髂骨植骨块中RORyt表达量为(2.1±0.2)ng/,结核病骨组织中浓度高于血液中及自体髂骨植骨块中浓度(P0.05);(5)Th17细胞表型脊柱结核病骨中Th17细胞表达CD45RO表型特征比例为87.4%±6.8%,表达CD45RA为5.9%±1.8%,比较有统计学差异(P0.05);血液中Th17细胞表达CD45RO表型特征比例为69.3%±5.4%,表达CD45RA为4.3%±2.0%,比较有统计学差异(P0.05)。 结论脊柱结核病骨及血液中存在Th17细胞,且在脊柱结核病骨中浓度升高,其表型特征为记忆性T淋巴细胞。 第二章Th17细胞在人脊柱结核血液及病骨组织中上调的相关研究 目的探讨上调Th17细胞作用的细胞因子及趋化因子种类,探讨Th17的来源。 方法收集10例行脊柱结核病灶清除、植骨减压融合内固定术配合抗结核药物治疗的患者入院时、术中及术后1周的血液标本,脊柱结核病骨及术中取自体髂骨植骨块标本。酶联免疫吸附法(ELISA)检测标本中IFN-y、IL-1β、IL-6、IL-23及TGF-a浓度;制备纯化后的原始CD4+T淋巴细胞后与IL-1β、IL-6、IFN-γ、TNF-β单独或混合培养后计数Th17细胞比例变化;以ELISA法检测成骨细胞表达CCL20、CCL22、CCL27浓度,免疫荧光染色及激光共聚焦显微镜观察成骨细胞表达CCL20、CCL22、CCL27形态;观察Th17趋化指数变化。流式细胞术观察结核病骨及血液中Th17细胞表达CCR受体及CCL配体的关系 结果(1)、脊柱结核组入院前血液中IL-1β为1437.0±73.0pg/L,术中为1167.0±81.6pg/L,术后1周血液中IL-1β为761.3±57.8pg/L;脊柱结核组入院前血液中IL-6为784.1±87.7pg/L,术中为693.5±85.7pg/L,术后1周为217.8±97.5pg/L;脊柱结核组入院前血液中IL-23为258.4±64.7pg/L术中为254.2±54.1pg/L,术后1周为126.6±92.4pg/;脊柱结核组入院前血液中CCL20为31.3±2.5pg/,术中为54.2±7.1pg/,术后1周为26.5±9.9Pg/L;脊柱结核病骨中CCL20为831.3±2.5pg/L, CCL22为947.1±7.1pg/L, CCL27为932.8±5.2Pg/L;自体髂骨块中CCL20为16.1±2.4pg/CCL22为12.5±0.4pg/,CCL27为132.8±5.2pg/;IL-6、IL-23及TGF-p浓度均明显升高(P0.01)。结核组中Th17细胞比例与IFN-y-IL-1p、 IL6、IL-23及TGF-p浓度之间均呈显著正相关关系(P0.05)。结核病骨中的配体趋化因子CCL20、CCL22和CCL27显著高于血液中的浓度及术中取自体髂骨块中的浓度(P0.05)。(2)、脊柱结核病骨Th17细胞表面表达CCR4的细胞比例为:67.3%±2.3%,CCR6为:72.4%±4.1%,CCR10为:56.8%±2.3%,而CCR2为:2.4%±0.3%、CCR3为:21.5%±4.6%,CCR5为3.7%±0.5%。术前血液中Th17细胞表面表达CCR4的细胞比例为:54.3%±6.2%,CCR6为:69.3%±6.2%,CCR10为:52.5%±7.1%,而CCR2为:3.8%±1.5%、CCR3为:24.1%±6.8%,CCR5为2.2%±1.4%。结核病骨中的Th17细胞趋化因子受体表达显著高于血液中(P0.05)。(3)、Th17趋化指数变化单独加入a-CCL20后Th17细胞及成骨细胞趋化性均减弱,共同加入a-CCL20、 a-CCL22和a-CCL27后Th17细胞趋化指数下降最为明显。 结论结核病骨组织及血液中趋化因子受体及配体在炎性因子作用下上调,其中IL-6、IL-1β、TNF-α上调Th17细胞分化,而IFN-Y抑制Th17上调。脊柱结核病骨中Th17细胞的来源包括两方面:1,自身局部组织Th17细胞的分化增殖;2,在CCL20-CCR6趋化轴、CCL22-CCR4和CCL27-CCR10趋化轴的作用及成骨细胞自身趋化作用下,将Th17细胞自血液中募集至病骨组织中。 第三章人脊柱结核病骨中成骨细胞抗原递呈性及其免疫调节功能的相关研究 目的探讨脊柱结核患者病骨中Th17细胞对成骨细胞增殖的影响及成骨细胞对Th17细胞的抗原递呈性。 方法10例脊柱结核患者为实验组,采用改良酶消化法获取脊柱结核病骨中的成骨细胞后培养,待成骨细胞于培养皿融合平铺后以移液管于中部画出等距离间隙制作成骨细胞损伤模型,将IL-17、IL-22、IFN-y及其对应抗体分别与损伤模型共培养,观察不同时间点成骨细胞融合情况。成骨细胞予碱性磷酸酶试验及茜素红试验鉴定;流式细胞技术检测脊柱结核病骨成骨细胞及术中取自体髂骨块成骨细胞表面HLA-DR、CD80和CD86,将血液中纯化的CD4+T淋巴细胞在有或无结核抗原85B情况下与IL-17、IL-22、成骨细胞、IFN-y以及抗CD80、CD86单克隆抗体组合混合培养,检测T细胞增殖标记细胞Ki-67+CD4+T细胞数量及Th17数量。 结果 (1)、在结核病骨中分离出的成骨细胞表达IL-22R比例为59.6%±4.6%、IL-17R为68.9%±7.2%、IFN-Y R为51.9%±5.9%;(2)、IL-22、IL-17促进成骨细胞增殖及活力,而IFN-Y抑制成骨细胞及活力。anti-IL-22、anti-IL-17抑制成骨细胞增殖,而anti-IFN-γ促进成骨细胞增殖;(3)、从结核病骨中分离出来的成骨细胞表达HLA-DR的比例为90.4%±3.9%,表达CD80为87.3%±4.1%,表达CD86为93.2%±7.2%,在有结核杆菌特异性抗原85B存在的条件下,Ki-67+CD4+T细胞显著降低,结核病骨单细胞悬液中Ki-67+CD4+T细胞(有成骨细胞条件下)明显增高;(4)、Th17细胞在有成骨细胞及85B存在时显著增高,IL-17及IL-22、IFN-γ均可显著增加Th17细胞数量,抗CD80、抗CD86及CTLA-41g使Th17细胞明显下调。 结论Th17细胞促进成骨细胞损伤修复及增殖;脊柱结核病骨中成骨细胞具有呈递抗原的能力,并通过呈递抗原信息促进CD4+T淋巴细胞增殖;成骨细胞呈递抗原的结果是刺激Th17细胞的发生和分化。


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