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不同类型精子发生障碍全基因组甲基化差异分析与重要功能基因的表达验证

李慕军  
【摘要】:目的:应用高密度基因芯片技术分析不同类型精子发生障碍的DNA损伤甲基化基因差异水平。 材料与方法:收集72份正常生育男性精液和不同类型男性不育症患者精液标本,提取精子DNA,行重亚硫酸盐转化,与Illumina HD450K Infnium Methylation BeadChip芯片杂交,分析不同类型精子发生障碍的成年男性与健康有生育能力成年男性精子中的DNA甲基化水平差异情况。 结果:正常生育男性精子和少精症男性精子共687个基因存在DNA甲基化水平差异(Diff Score值50,P0.00001),甲基化程度升高基因568个,甲基化程度降低基因119个,正常生育男性精子和弱精症男性精子共2231个基因存在甲基化水平差异(Diff Score值50,P0.00001),甲基化程度升高基因1811个,甲基化程度降低基因420个;正常生育男性和不明原因不育男性精子共1550个基因存在甲基化水平差异(Diff Score值50,P0.00001),甲基化程度升高基因1154个,甲基化程度降低基因396个;对获得的差异基因进行聚类分析,结果提示:少精症男性精子DNA甲基化差异主要集中在细胞凋亡相关、细胞周期蛋白类相关基因,弱精症男性精子DNA甲基化差异多集中在离子通道和运输蛋白、细胞骨架和鞭毛运动等相关基因。不明原因不育男性精子DNA甲基化改变多集中在移植排斥、免疫相关、内分泌代谢相关基因。这些基因的DNA甲基化改变可能是导致不同类型精子生成障碍的原因之一。 结论:应用全基因组高密度甲基化芯片对不同类型精子生成障碍患者进行的系统研究表明:不同类型精子生成障碍患者的精子有不同的甲基化类型,这些DNA甲基化差异的发现,为进一步研究不同类型精子发生障碍的机理及其防治新方法的研究奠定了基础。 目的:探讨不同类型精子发生障碍人群中MMEL1与TEKT5基因的mRNA转录表达情况,为阐明精子发生障碍的分子机制奠定基础。 方法:应用实时定量反转录聚合酶链式反应(qRT-PCR)的方法,设计了两对特异性扩增引物,分别以正常、弱精和少精症组cDNA为模板,分别扩增、分析正常精子和异常精子中MMEL1与TEKT5基因在mRNA水平的差异。 结果:通过RT-PCR扩增,分别获得特异性的扩增条带,MMEL1约133bp,TEKT5约155bp和GAPDH约248bp。随后的QRT-PCR扩增曲线和融解曲线表明:MMEL1, TEKT5以及内参基因GAPDHPCR扩增的特异性均较强。对实时荧光定量PCR得出的不同来源样本中目的基因的相对表达量进行多重比较分析显示,弱精和少精症的MMEL1及TEKT5的mRNA表达水平均低于正常试验组。MMEL1mRNA在正常组中的相对表达量显著高于弱精组(0.696vs.0.329,P=0.0000.05),与少精组的差异没有显著意义(0.696vs.0.665,P=0.9720.05),而弱精组的MMEL1mRNA相对表达量也显著低于少精组(0.329vs.0.665,P=0.0000.05)。对不同样本中TEKT5mRNA的相对表达量进行统计分析正常组与少精组中TEKT5mRNA的表达量均显著高于弱精组(0.681vs.0.316, P=0.0000.05,0.527vs.0.316, P=0.0080.05),而正常组与少精组之间的差异没有显著意义(0.681vs.0.527,P=0.2040.05)。 结论: 1、MMELl mRNA在弱精组的相对表达量显著低于正常组、少精组,但正常组与少精组的差异没有显著意义。 2、正常组与少精组中TEKT5mRNA的相对表达量均显著高于弱精组,而正常组与少精组之间的差异也无显著意义。 3、MMELl和TEKT5基因甲基化修饰可能表现沉默效应,为阐明弱精症发生的分子机制提供了初步的研究基础。


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