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纳米铜和微米铜的毒性比较研究

廖明阳  
【摘要】:纳米科学与技术在世界范围内均是动态发展、急剧变革的新兴领域;在欧洲、北美及其国内也都是优先开发的科学前沿。故此,纳米技术常常被称之为先驱技术。纳米技术的商业应用也逐步增多,包括电子技术、运动服装、轮胎、耐污染衣料、化妆品以及诊断成像或投送药物的载体。随着纳米技术产品广泛商业化,人类暴露纳米材料及其产品的可能性也急剧增加,评价其毒性和安全性也因而具有极为重要的意义。近年的研究表明,包括纳米铜在内的、应用最广泛的金属纳米粒子在体内外均可诱发不良效应,导致纳米材料因其独特表面活性、催化性质和磁性而引起潜在毒性并受到广泛关注。迄今为止的研究提示,纳米材料的行为和效应并非总能从其它类型纳米材料的现有研究结果预测出来。此外,虽然纳米材料与普通微米材料的组成相同,但在原子和量子水平具有不同于微米材料的性质和行为。故此,纳米毒理学研究的策略、模式、方法和工具均有别于传统的毒理学。纳米铜粒子也是极具代表性的一种金属纳米材料,并且业已作为商业产品如纳米级抗衰老、抗骨质疏松症的治疗药物进入主流市场。虽然.纳米铜材料与我们人类愈来愈关系密切,但是,迄今为止仍仅开展了少量得研究,其结果显示纳米铜材料可能对人类或者其环境可能存在一定的危害。 基于上述考虑,本课题首先采用原子力显微镜、无细胞孵育体系等技术对纳米铜和微米铜的原料本身及其在体外培养体系、给药溶媒和人工胃液中的离子化行为进行全面的鉴定,并以单价铜离子特异性螯合剂BCS为工具药探索离子化过程动力学对纳米铜体外毒性效应的潜在影响,分析离子化过程在纳米铜发挥体外毒性中的作用。其次,以大鼠为模型,研究单次和连续5天给予纳米铜及微米铜引发毒效应的表现、靶器官,通过体重、摄食量、临床体征、临床病理学、解剖病理学等一般毒性检测指标和超微结构分析、生物标志物检测、流式细胞分析等新技术探讨纳米铜诱发肝脏、肾脏、免疫系统、生殖系统毒性的特征和细胞与分子机制,分析毒性表现与铜粒子尺寸、表面积、表面活性等理化性质之间的相关性。最后,采用大鼠全基因组基因芯片技术分析研究纳米铜及微米铜处理大鼠的肾脏组织基因表达水平,结合传统毒理学毒性体征的整合分析和表型锚定探索与纳米铜肾毒性密切相关的靶基因和信号转导通路,进而阐明纳米铜肾毒性发生发展的毒理基因组学机制。本课题的研究目的在于:进一步利用动物模型观察纳米铜的毒理学效应,揭示纳米铜的潜在靶器官和毒效应特征,并利用体外细胞模型和现代组学技术探讨纳米铜的毒性机制,为纳米铜的安全性评价、毒性监测及干预提供理论依据。 在理化鉴定过程中,利用扫描电子显微镜、动态光散射技术、BET比表面积分析仪和X射线荧光光谱法分别对纳米铜的粒径及分布、比表面积和纯度等理化性质进行表征,结果显示:纳米铜的平均粒径及分布为25nm(5-60nm),比表面积为6.93±0.03m2/g,纯度不低于99.9%。受试物纳米铜要明显小于参比物微米铜’(平均粒径171μm,表面积0.2g/m2)。再后再采用MTT法和LDH漏出率测定纳米铜的细胞毒性,并采用一价铜特异性螯合剂、分光光度法、ICP-AES来分析纳米铜粒子在培养体系、给药溶媒中的溶出度。实验结果发现,纳米铜可剂量依赖性地诱导细胞存活力下降,作用24h后对HK-2细胞毒性的IC50值为41.3μg/ml;纳米铜还可剂量依赖性地引发细胞LDH漏出量增加。然而,-价铜离子的特异性螯合剂BCS可相应地抑制纳米铜或氯化铜所诱导的细胞毒性。随着溶液中纳米铜颗粒添加时间的逐步延长,在157.5和315μmol/L浓度下的纳米铜粒子处理体系中,二价铜离子的水平也开始逐渐升高,与此同时培养体系中的纳米铜粒子的溶解率也出现时间依赖性的升高趋势。ICP-AES法定量分析的进一步结果表明:在人工胃液中纳米级的金属铜粒子和微米级的金属铜粒子在溶解速率上存在明显差别;作用5分钟后,纳米级铜粒子在人工胃液中的溶解率达1.2%;其后,铜离子的升高幅度才逐渐变缓,到达2小时时则达到了平台期,其相应的溶解率为2.1%。相同条件下,微米铜的溶解率仅在60-120min之间出现小幅度升高,其溶解率从0.21%上升至0.67%(与纳米铜相比,有明显差异)。在相同质量浓度下,纳米铜对HK-2系肾小管上皮细胞的毒性要明显地高于微米铜。上述结果提示:纳米铜粒子要发挥其生物效应并增强其毒性作用,其中的较小尺寸、较大的表面积、以及较高的表面活性是其中的重要化学结构基础,纳米铜诱导毒性的重要方式为转化为铜离子,单价铜离子螯合剂可明显拮抗纳米铜诱导的毒性,进而可能应用于纳米铜的中毒治疗。 大鼠单次经口急性毒性上下法实验表明,纳米铜的LD50(95%置信区间)为834.3(790~930) mg/kg;限量试验中,2000mg/kg剂量下三只大鼠全部死亡,而微米铜在相同剂量下则仍未导致大鼠死亡。纳米铜的毒性体征与文献报道的可离子化铜化合物的急性毒性体征相近,提示经口给予纳米铜的毒性可能归因于离子化效应。 大鼠连续经口给予纳米铜5天的毒性靶器官为肝脏、肾脏、胃脏、免疫系统和附睾。肝毒性主要表现为肝细胞肿胀、点状或小灶状肝细胞嗜酸性坏死以及中性粒细胞与淋巴细胞等炎细胞浸润。临床生化表现为血清ALT和AST水平升高,TP、Alb、Glo水平的显著下降。肾毒性主要表现为剂量依赖性的肾小管上皮轻度至中度的玻璃样变性。临床生化表现为BUN显著升高和血清中GST-α、KIM-1和β2-MG三种生物标志物的明显改变。纳米铜的胃毒性为本课题首次发现,其主要表现为胃粘膜浅层明显淤血与充血、局部出血、固有层腺体腺上皮胞浆空化、部分胞核溶解消失。免疫毒性主要表现为中性粒细胞数显著升高、淋巴细胞数显著降低、血清补体C3、C4水平升高和IgA抗体水平上升。附睾毒性主要表现为附睾绝对和相对重量剂量依赖性下降以及高剂量下的精子运动性(包括运动精子的百分率)下降。纳米铜染毒5天后,肝肾组织的氧化还原防御酶SOD和GSH-PX水平代偿性升高。 利用基因组学技术研究纳米铜染毒5天大鼠肾脏的基因表达谱发现:在纳米铜100mg/kg和200mg/kg处理组大鼠肾脏中均发生改变的差异基因,其涉及的生物学过程主要包括:生物学调节、应激反应、对损伤的反应、防御反应、脂质代谢、急性炎症反应和损伤修复等过程。涉及的分子功能主要集中在酶调节剂的活性、转运体活性、酶抑制剂活性、蛋白酶抑制剂活性、内肽酶抑制剂活性和脂质结合等方面。 综合以上研究结果,我们初步得出以下结论:纳米铜粒子因其相对较小的粒径、较大的比表面积和高表面活性而较同等剂量的微米铜粒子更易于在培养基体系和人工胃液内发生离子化反应并转化成为铜离子,从而造成较微米铜粒子更强烈的体外细胞毒性、单次体内给药毒性和反复给药5天的亚急性毒性。雄性大鼠经口染毒5天的毒性作用靶器官主要为肝脏、肾脏、胃脏、免疫系统和附睾。同等条件下,纳米铜的毒性明显高于微米铜。纳米铜的毒性主要机制之一与活性氧与抗氧化物质的动态平衡,引起氧化应激有关。肾组织毒理基因组学分析结果发现:氧化应激反应可能是纳米铜粒子引起大鼠肾损伤的一条重要途径。三羧酸循环和氧化磷酸化等能量代谢途径受到抑制,则有可能成为纳米铜粒子引起大鼠肾脏毒性的一种作用机制。纳米铜所引发的信号功能通路中差异表达的相关基因和/或蛋白可作为研究纳米铜诱发肾损伤的生物标志物。


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