基于斑马鱼胚胎评价体系的氯化两面针碱对心血管作用的研究

【摘要】：目的：（1）研究氯化两面针碱对不同时间点斑马鱼胚胎形态和心脏发育的影响，为斑马鱼胚胎用于药物的安全性评价提供依据。（2）建立适用于本实验室的斑马鱼胚胎血管生成评价方法，评价氯化两面针碱对斑马鱼胚胎血管生成的影响，并探讨其抑制血管生成的可能机制。 方法：（1）预实验基础上，三个给药组均设计5个药物浓度，即6hpf未脱膜组（8.53、9.48、10.53、11.70、13.00mg/L），24hpf未脱膜组（19.68、21.87、24.30、27.00、30.00mg/L），24hpf脱膜组（16.40、18.23、20.25、22.50、25.00mg/L），并以Holt buffer溶液为空白对照组，含等量DMSO为溶剂对照组，共7个实验组。分别于显微镜下挑选正常发育至6hpf和24hpf胚胎，随机分组给药，观察药物处理至72hpf时胚胎的畸形和死亡情况。（2）实验分组和给药方法同上，分别于发育后48hpf、54hpf、60hpf和72hpf时观察斑马鱼胚胎心脏形态及心率变化。（3）前期实验基础上设计4个药物浓度组（8.19、10.24、12.80、16.00mg/L），以Holt buffer溶液为空白对照组，含等量DMSO为溶剂对照组，共6个实验组，通过NBT/BCIP血管染色法观察氯化两面针碱对斑马鱼胚胎72hpf肠下静脉血管和48hpf节间血管生成的影响。（4）4个药物浓度组（8.19、10.24、12.80、16.00mg/L）均同时给予VEGF诱导，以Holt buffer溶液为空白对照组，单含50μg/LVEGF的为VEGF组，及含等量VEGF和DMSO的溶剂对照组，共7个实验组，通过NBT/BCIP血管染色法观察氯化两面针碱对VEGF诱导的斑马鱼胚胎72hpf肠下静脉血管和48hpf节间血管生成的影响。（5）正常发育至24hpf胚胎经脱膜后，暴露于4个药物浓度组（8.19、10.24、12.80、16.00mg/L），含等量DMSO为空白对照组，共5个实验组，通过半定量RT-PCR法检测72hpf斑马鱼胚胎VEGF、FGF2、EGF及相关受体基因表达的变化。 结果：（1）不同时段给药的LD50依次为：24hpf未脱膜给药组24.16mg/L24hpf脱膜给药组20.56mg/L6hpf未脱膜给药组10.50mg/L，但治疗指数（TI）和安全指数（SI）基本相同。（2）各给药组在观察时间点均出现不同程度的心脏畸形表现，随着药物浓度的增加，胚胎心率呈剂量依赖性和时间依赖性下降。(3)氯化两面针碱剂量依赖性抑制斑马鱼胚胎节间血管和肠下静脉血管生成。(4) VEGF诱导后可促进斑马鱼胚胎节间血管和肠下静脉血管生成，氯化两面针碱剂量依赖性抑制VEGF诱导后斑马鱼胚胎节间血管和肠下静脉血管生成，相较于使用正常斑马鱼胚胎血管生成抑制率略微增加。(5)氯化两面针碱剂量依赖性下调斑马鱼胚胎血管生成相关因子VEGF及其受体和FGF2、EGF的mRNA表达，但对后者相关受体基因的表达基本无影响。 结论：(1)6hpf斑马鱼胚胎对氯化两面针碱的药物敏感性大于24hpf给药，绒包膜对胚胎的发育有一定的保护作用。(2)氯化两面针碱可影响斑马鱼胚胎心脏发育，且给药时间越早胚胎心脏发育对药物敏感性越高，绒包膜可减弱药物的影响。(3)氯化两面针碱可以抑制斑马鱼胚胎血管生成。（4）氯化两面针碱对VEGF诱导的斑马鱼胚胎血管生成有抑制作用，应用VEGF后可一定程度促进斑马鱼胚胎血管生成，但药物抑制率并无显著提高。（5）氯化两面针碱抑制斑马鱼胚胎血管生成的机制可能与影响VEGF及其受体和FGF2、EGF基因水平的表达有关。