收藏本站
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

蜂毒素作用于组织蛋白酶S抗肝癌血管生成机制研究

张智  
【摘要】:研究背景肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是非常普遍和病死率极高的恶性肿瘤,位居我国恶性肿瘤死亡率第二位,严重危害人民健康。流行病学研究表明慢乙肝病毒(HBV)或丙型肝炎病毒(HCV)感染是肝癌发生的主要危险因素,其次酗酒、黄曲霉素食品污染都和肝癌密切联系。分子生物学研究表明肝癌发生发展、转移复发是一个多步骤多因素过程,涉及细胞内一系列复杂变化,其中肿瘤血管生成起重要作用。此外,肝癌的发病隐匿,不易早期诊断,等患者出现典型症状往往已经发展到肝癌中晚期,失去了有效治疗时间。最近研究表明,目前肝癌首选治疗方法仍是手术,但即使早期手术切除的小肝癌,5年内仍有50%左右的转移复发率。因肝癌的发生发展是多因素共同参与,临床上治疗肝癌的许多药物作用机制靶向性过强,仅仅针对肝癌发生机制中某一因素,适应人群偏少,且患者极易出现耐药和不同程度毒副反应,总体上不能获得理想治疗效果。因此,研发新的抗肝癌药物,对我国这样一个肝癌高发国家而言,有着极其重要的理论意义和应用价值。组织蛋白酶是一类在酸性PH环境中被活化的溶酶体蛋白酶,属于半胱氨酸蛋白酶,在人类基因组中,11种不同的蛋白酶分别被编码为组织蛋白酶B, C, F, H, K, L, O, S, V, W, X (Z)。1986年,Kirschke首次从牛的脾脏中提取出组织蛋白酶S(Cathepsin S, CTSS/CatS),并证实其属半胱氨酸蛋白水解酶,主要分布在脾脏、淋巴结、心脏、抗原提呈细胞,与Cat L、 Cat H、Cat B分别有57%、41%、31%的序列同源性。CTSS是最重要的蛋白酶之一,正常情况主要在淋巴器官表达。CTSS在人类各种癌症发现过表达,如肝癌、胰腺癌、乳腺癌、胰腺癌等。虽然CTSS主要位于溶酶体内,越来越多证据表明,它可以易位到细胞表面,分泌到细胞外环境,参与调节细胞凋亡,降解动脉细胞外基质(ECM)粘连蛋白、胶原蛋白、弹性蛋白等大分子和基质金属蛋白酶-2(MMP-2),同时释放基质衍生的生长因子,促进新生血管生成,加速肿瘤细胞浸润和转移。此外,靶向抑制CTSS表达可显著抑制肿瘤血管生成、腺癌模型侵袭和血管生成。Claire Ward等发现靶向抑制CTSS与抗VEGF有协同作用。因此,以VEGF/VEGFR为靶点,研发新的血管生成抑制剂已成为肝癌生物治疗的一个热点。我国的中药资源丰富,许多动植物中提取的生物活性成分经研究证明具有抗肝癌血管形成作用,并在临床广泛应用。所以,寻找和开发新的生物活性成分,探索其抗肝癌血管形成机理,能为肝癌抗血管治疗提供新的理论和实验证据。基于本实验组前期研究基础,我们选择蜂毒素单体(蜂毒的有效活性成分)作为了研究对象。蜂毒素(Melittin)是蜜蜂毒液中的主要成分,由26个氨基酸组成的两性肽。研究表明蜂毒能诱导细胞膜结构改变,包括小孔形成、融合和囊泡。研究表明蜂毒素具有多种作用,包括抗菌、抗病毒和抗炎等作用。研究证实蜂毒素可诱导肿瘤细胞周期阻滞,抑制其增殖和凋亡。然而,蜂毒素抗癌作用机制尚未完全阐明。本课题组前期研究证实蜂毒素能抑制HCC细胞增殖和肿瘤生长。另外,在MHCC97-H细胞沉默CTSS基因显著抑制血管内皮生长因子分泌和人脐静脉内皮细胞管状结构形成。提示血管内皮细胞在形成血管的几个关键环节可能和蜂毒素抑制作用有关。据以上研究我们推测,蜂毒素可能靶向作用于CTSS,抑制抗血管生成、肿瘤转移,但其作用机制仍需进一步探讨。研究目的:(1)研究沉默CTSS是否影响MHCC97-H细胞的生物学功能,并进一步探讨蜂毒素是否通过调控CTSS抑制肿瘤生长和肝癌血管形成;(2)揭示在蜂毒素作用下,探讨CTSS与VEGF-A/VEGFR2/MEK1/ERK1/2通路中相关蛋白相互调节机制,明确对肝癌血管形成的机制。研究方法:(1)通过Western-blot和RT-PCR实验筛选高表达CTSS的MHCC97-H肝癌细胞株;(2)利用慢病毒感染的方法,制备shRNA-CTSS/MHCC97-H稳定株;(3)通过体外细胞克隆形成实验、MTT实验、流式细胞术分析实验、Transwell chamber实验和划痕实验观察shRNA-CTSS对MHCC97-H生物行为学的影响;(4)利用体外细胞克隆形成实验、MTT实验、流式细胞术分析实验、Transwell实验、划痕实验和ELSIA实验观察稳定转染的MHCC97-H细胞株,在不同浓度的蜂毒素作用下,对增殖、凋亡、周期、细胞活性和细胞迁移的影响;通过Western blot实验观察蜂毒素能否通过调控CTSS,明确和VEGF-A/VEGFR2/MEK1/ERK1/2信号通路中相关蛋白存在的作用环节及机理;(5)合成CTSS-RNA,瞬间转染人脐静脉细胞,利用Transwell实验、内皮细胞小管形成实验,观察不同浓度的蜂毒素作用下对人脐静脉细胞浸袭和小管生成的影响;(6)建立裸鼠肝原位移植瘤模型,采取小鼠腹腔途径给药的方法,分别设立对照组(注射PBS)、蜂毒素处理组(80 mg/kg/d),观察各组间肿瘤体积大小和血管密度等差异,评估蜂毒素体内抗肿瘤血管形成效应。研究结果:1.筛选出高表达CTSS的MHCC97-H细胞株。采用RT-PCR和Western-blot检测8种细胞株CTSS的表达情况。结果显示,MHCC97-H细胞CTSS表达最高,其次为BeL-7402和MHCC97-L、 SMMC-7721、Hep3B, LO2、Huh7和HepG2表达偏低。2. shRNA-CTSS/MHCC97-H稳定株和生物学。观察shRNA-CTSS有效沉默MHCC97-H细胞CTSS基因的表达,影响其细胞周期和凋亡,抑制克隆形成、迁移和浸袭。3.蜂毒素抑制Mock/MHCC97-H稳定细胞株生长、侵润和迁移。实验结果证明,和shRNA-CTSS/MHCC97-H相比,蜂毒素明显抑制Mock/MHCC97-H生长、克隆形成、VEGF分泌和浸袭能力(P0.05)。4.蜂毒素调控Mock/MHCC97-H细胞VEGF-A/VEGFR2/MEK1/ERK1/2信号通路中相关蛋白的表达。Western-blot实验结果显示,蜂毒素明显抑制Mock/MHCC97-H细胞CTSS、VEGF-A、Ras、p-Raf、p-MEK1、p-ERK1/2蛋白的表达。5.蜂毒素抑制]SUVECs小管形成和侵袭CTSS-RNA使CTSS在HUVECs中过表达。和Mock-HUVECs相比,蜂毒素能明显抑制CTSS-HUVECs小管形成和通过Matrigel的侵袭能力(P0.05)。6.蜂毒素抑制裸鼠肝原位移植瘤的生长和肿瘤血管形成。和对照组相比,蜂毒素明显抑制Mock/MHCC97-H组裸鼠瘤体积和CD34的表达,也明显抑伟CTSS、VEGF-A、Ras、p-Raf、p-MEK1、p-ERK1/2蛋白的表达。研究结论:沉默CTSS明显影响MHCC97-H细胞的生物学行为;蜂毒素可能通过调控CTSS,阻断VEGF-A/VEGFR2/MEK1/ERK1/2信号通路,抑制肿瘤生长和肝癌血管生成,提示蜂毒素可能是CTSS的抑制剂,有望成为一种潜在的治疗肝癌药物。


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前20条
1 卢逸;林楠;陈之巨;许瑞云;;人肝癌相关成纤维细胞与肝癌血管生成的相关性研究[J];中华肝脏外科手术学电子杂志;2017年03期
2 周合山,章士正;血管内皮生长因子与肝癌关系研究进展[J];浙江医学;2005年01期
3 叶义标;陈涛;;肝癌血管生成与抗血管生成治疗的研究进展[J];中国普外基础与临床杂志;2009年10期
4 刘晓琳;翟笑枫;;肝癌术后综合治疗研究进展[J];中西医结合肝病杂志;2017年02期
5 戴朝六;贾昌俊;;以外科手术为主的肝癌多学科综合治疗[J];腹部外科;2017年02期
6 刘亚君;;HBsAg被清除后仍有可能发生肝癌[J];山东医药;2009年32期
7 邓靖宇,何生;VEGF在肝癌中作用[J];世界华人消化杂志;2004年02期
8 梁宾勇;黄志勇;陈孝平;;精准医学背景下肝癌的治疗策略[J];临床外科杂志;2017年01期
9 魏丽珍;李胜棉;张楠;温登瑰;周烨;王士杰;;688例肝癌患者发病特点及诊疗状况分析[J];肝脏;2010年02期
10 林礼务;林振湖;;经皮肝癌消融治疗的现状与进展[J];中华医学超声杂志(电子版);2007年01期
11 张斐斐;复发肝癌再切除12例治疗体会[J];临床外科杂志;1999年03期
12 ;美国肝癌发病增加迅速[J];中国肿瘤;1999年10期
13 杜晓炬,程广明,陈成彦,李荫山;以梗黄为首发症状的肝癌9例诊治分析[J];中国实用外科杂志;1997年01期
14 姚桢,姚秀文;肝癌的早期发现和治疗研究进展[J];胃肠病学和肝病学杂志;1997年03期
15 尤然;黄健;;外泌体与肝癌的研究进展[J];江苏医药;2017年06期
16 范文文;;肝癌,请你离开我[J];养生大世界;2018年11期
17 郑晶;陈艳清;郭霞;;106例肝癌患者行胃镜检查的护理配合[J];当代医学;2013年28期
18 张志敏;;肝癌会遗传吗?[J];肝博士;2006年03期
19 段红罡,贾广亚,李灵军;经导管肝动脉化疗栓塞后Ⅱ期切除肝癌12例[J];河南外科学杂志;2000年04期
20 李霞;肝癌患者的评价和护理问题[J];国外医学.护理学分册;1996年02期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 孙惠川;周俭;朱小东;汤钊猷;樊嘉;;肝癌术后复发死亡风险评估和辅助治疗[A];第十五届全国肝癌学术会议资料汇编[C];2015年
2 谢晓燕;徐辉雄;吕明德;殷晓煜;匡铭;徐作峰;刘广健;;反复超声引导经皮消融治疗复发性肝癌[A];中华医学会超声医学新进展学术会议论文汇编[C];2004年
3 武金才;陆才德;彭淑牖;戴德坚;;再切除在肝癌复发治疗中的作用和地位[A];衢州市自然科学优秀论文选编(2001-2004)[C];2005年
4 胡和平;;中晚期肝癌全身治疗现状与进展[A];中华医学会第七次全国消化病学术会议论文汇编(下册)[C];2007年
5 肖恩华;;TACE治疗肝癌基础与临床研究[A];第二届全国非血管性与血管性介入新技术学术研讨会暨第三届介入放射学新技术提高班论文汇编[C];2005年
6 贾丽军;于石成;胡跃华;徐成东;冯国双;么鸿雁;李旭东;刘韫宁;;多水平模型在肝癌死亡病例与关联因素生态学分析中的应用[A];2017年中国卫生统计学学术年会论文集[C];2017年
7 马怀英;;中国肝癌致病原因分析与防治对策[A];新世界中国教育发展论坛(第三卷)[C];2007年
8 左朝晖;李永国;肖华;许若才;刘寒春;李建良;余志渊;欧阳永忠;邱晓昕;刘景诗;;结合湖南的实情论湖南特色的抗肝癌之路[A];第十五届全国肝癌学术会议资料汇编[C];2015年
9 陈雪娟;刘慧卿;王楠;张柏林;;基于适配子的微悬臂传感器在肝癌细胞检测中的应用[A];中国化学会第30届学术年会摘要集-第四分会:生物分析和生物传感[C];2016年
10 谢晓燕;徐作峰;徐辉雄;匡铭;王竹;黄蓓;吕明德;;实时虚拟导航引导肝癌消融治疗的研究[A];中国超声医学工程学会第一届全国介入超声及肿瘤消融学术会议论文汇编[C];2011年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 张智;蜂毒素作用于组织蛋白酶S抗肝癌血管生成机制研究[D];广西医科大学;2015年
2 钟崇;健脾化瘀法中药治疗肝癌的临床与实验研究[D];广州中医药大学;2014年
3 朱观南(Chee Yong Sung);肝癌的中西医治疗法及规律研究[D];山东中医药大学;2010年
4 韩建立;原代肝癌细胞体外培养化疗敏感实验研究[D];山西医科大学;2010年
5 邹奇飞;肝癌中具有转移特性肿瘤干细胞的鉴定研究[D];第二军医大学;2009年
6 卢杉;长链非编码RNA:HOXD-AS1在肝癌中的功能和机制研究[D];第二军医大学;2015年
7 曾映荷;扶正抗癌方治疗中晚期肝癌的临床研究[D];湖北中医药大学;2015年
8 毕承明(Pi Cheng Ming);肝癌证治规律文献研究[D];南京中医药大学;2015年
9 张洪新;肝癌生物标本库的建立及应用[D];第四军医大学;2010年
10 崔永安;原发性肝癌的中西医结合治疗及砒霜制剂抗肝癌肿瘤血管形成的实验研究[D];南京中医药大学;2003年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 黄磊;一组蛋白降解相关分子在肝癌进展中的作用研究[D];第二军医大学;2012年
2 禹鸿鸣;醛缩酶B在索拉非尼治疗肝癌的耐药作用研究[D];第二军医大学;2015年
3 平骁功;pcDNA3.1-UC001kfo的构建及对肝癌细胞侵袭能力的影响[D];郑州大学;2014年
4 时志龙;肝硬化影响循环肝癌细胞形成复发转移的研究[D];苏州大学;2014年
5 孙海艳;骨桥蛋白在肝癌中的表达及与转移相关的糖基化改变[D];复旦大学;2012年
6 陈浩;细胞外基质蛋白-1在肝癌中的表达及其临床意义[D];安徽医科大学;2011年
7 张芬芬;白细胞介素-17与肝癌家族聚集性的关系[D];广西医科大学;2017年
8 梁芷冰;血管紧张素Ⅱ2型受体过表达对肝癌细胞体内外生长的影响[D];南方医科大学;2014年
9 吴晗;脂代谢在肝癌营养应激中的作用和调控机制[D];第二军医大学;2014年
10 朱观南;中国台湾地区的肝癌诊治[D];山东大学;2009年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 通讯员 杨静 记者 唐闻佳;肝癌干预治疗有了新策略[N];文汇报;2014年
2 湖北日报全媒记者 崔逾瑜 胡蔓 通讯员 魏薇;肝癌良药正在审批路上[N];湖北日报;2018年
3 中国青年报·中青在线记者 诸葛亚寒;我国科学家新发现有望实现肝癌“早发现、早治疗”[N];中国青年报;2016年
4 陈青;全球年新发肝癌病例中国逾五成[N];文汇报;2008年
5 唐一尘;新基因剪刀助力肝癌建模[N];中国科学报;2019年
6 记者 吴苡婷 通讯员 杨静;上海科学家发现抑制肝癌新机制[N];上海科技报;2018年
7 本报记者 闫良生;警惕!肝癌位居我国肿瘤发病率第四位[N];河南日报;2015年
8 本报记者 张天一;如何早期发现和治疗肝癌[N];中国医药报;2016年
9 记者 崔芳;肝癌早诊早治有了更强有力工具[N];健康报;2016年
10 通讯员 吴志;肝癌虽险恶 “过招”有讲究[N];家庭医生报;2015年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978