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miR-130b通过抑制Notch-Dll1表达促进肝细胞癌侵袭转移的机制研究

欧超  
【摘要】:背景肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC),是在全世界范围内,最常见的恶性程度最高的恶性肿瘤之一,已成为世界范围内癌症死亡的第三大主要因素。据调查,70-85%的肝脏恶性化癌变与HCC密切相关,而中国的肝癌发生率约占此数值的一半。我国华南地区是HCC的高发区,其中广西是HCC的重灾区。广西区范围内肝癌死亡率呈现出持续增加的态势。肝癌高死亡的主要原因,在于肝癌的高转移复发率,但是肝癌高转移复发的精确调控机制,目前尚未完全清楚,目前对肝癌的治疗,仍然缺乏有效而可靠的治疗措施,和预防策略。因此,积极开展探究,肝癌的转移复发,的分子调控机制,并且采取积极有效的,治疗手段和预防方法,是有效提高肝癌患者治疗疗效、改善肝癌防治的预后的突破口。miRNAs(Micro RNAs,miRNAs),是一种长度大约为含17至25个核苷酸的、非编码的、单链的RNA小分子;广泛存在于真核细胞生物中的内源性基因表达的调控因子,在调控基因表达中发挥着重要的作用,广泛地参与多种病理生理过程,并与肿瘤的发生发展密切相关。miRNAs通过和靶基因mRNA的3'端非翻译区(3'Untranslated Regions,3'UTR)之间的相互作用,进行对靶基因,转录后表达水平的调节作用,继而参与细胞在调控自身的增殖和凋亡,分化和代谢等等的生理病理过程。然而,在机体中,通常异常表达的miRNAs分子,通常与包括恶性肿瘤在内的,多种疾病的关系密切,实现在肿瘤发生和发展的过程当中,可以充当癌基因或者抑癌基因的生理作用。近几年来,越来越多的研究,提示与肿瘤的侵袭和转移密切相关的miRNAs分子,备受广大学者在研究中密切关注,miRNAs分子可以在细胞的生理病理过程中,可以通过参与细胞活动之间的粘附和基质降解,EMT和血管生成,等多个作用环节,而发挥重要的调控作用,最近学者发现许多miRNAs分子,与转移密切相关的,已经被学者确认。比如,可以促进肿瘤的侵袭和转移的分子有mi R-130b、miR-151、miR-10b、miR-221、miR-21等,抑制肿瘤转移的有Let-7家族、miR-34a、miR-126等。大量研究证据表明,miRNA的表达失控与肝癌的发生发展密切相关,可在肝癌的形成过程中发挥着重要的调控作用,并且可以间接或直接参与肝癌细胞的发生发展、侵袭、远处转移等生理过程。其中mi R-130b基因已被证实,在不同的细胞背景或肿瘤微环境下,发挥的调控功能不近相同,比如,在相当一部分乳腺恶性肿瘤和食管恶性肿瘤当中,mi R-130b基因即可以促进肿瘤的侵袭转移。因此,miR-130b基因被称作促进肿瘤转移因子。而在恶性胶质细胞肿瘤中,miR-130b基因亦可通过阻止细胞周期进展,和抑制促凋亡基因的表达,促进癌细胞的增殖,并抑制细胞凋亡的发生。此外,也有研究学者证实,在肝癌干细胞的恶性转化的过程中,miR-130b基因表达呈现上调。提示,上调的mi R-130b基因,可能是通过保持肿瘤干细胞的生物特性的维持,参与了肝癌恶性化的发生和发展。Notch-Dll1基因是Notch配体Delta-like 1(Delta Like Canonical Notch Ligand 1,Dll1),定位于染色体6q27的蛋白编码基因,是一种经典的且在生物进化中高度保守的Notch信号网络中的5种Notch配体(Dll1、Dll3、Dll4、Jaggedl和Jagged2)之一,它们可在调节细胞分裂、分化、增殖、凋亡和肿瘤的发生等一系列生物学事件起了决定性作用,甚至几乎涉及生命代谢活动过程的所有环节。既往研究表明,Notch-Dll1可以通过细胞之间信号转导,参与黑素瘤血管生成,对肿瘤细胞粘附和转移产生影响。Notch-Dll1的选择性过表达可以拯救miR-130b-3p的抑制作用,沉默Notch-Dll1促进细胞侵袭和迁移的抑制,在乳腺癌细胞侵袭中起重要作用。然而,miR-130b参与肝癌侵袭转移的下游靶基因是哪些呢?他们又是如何对靶基因进行调控的呢?以及以miR-130b基因为调控靶点的干预,是否能有效的逆转,肝癌细胞恶性转化的侵袭和转移的表型呢?至今,这些问题还尚未清楚解释。因此,探讨miR-130b基因在肝癌的发生发展中的作用及其分子调控机制,提高对肝癌的诊治和寻找新的靶点是目前需要亟待解决的问题。目的检测mi R-130b在肝癌组织中的差异表达,探讨miR-130b表达水平与患者临床病理特征及预后的关系;明确miR-130b基因对肝细胞癌的恶性表型特征的影响,以及通过软件预测靶基因,和实验验证mi R-130b基因,对其下游靶基因的生物学功能及其作用,进一步阐明miR-130b基因在肝癌的侵袭和转移过程当中的调节作用,及其分子调控机制,为寻求有效治疗肝细胞癌新的靶点,提供理论依据。方法1.搜集肝细胞癌的患者46例(经过病理医生诊断证实,发生肝外转移的30例,未发生转移16例),手术切除的新鲜肝癌组织,和10例同期同医院的非肝癌的正常肝组织样本,使用实时荧光定量PCR实验(qRT-PCR)的方法,测定miR-130b基因在组织的表达水平,并分析mi R-130b基因的表达水平,与肝细胞癌患者的临床病理特征及患者预后评估的关系。2.体外探讨研究miR-130b基因,对肝癌细胞的生物学行为的影响:利用人工合成的miR-130b模拟物(miR-130b mimics,mi R-130b)、miR-130b抑制剂(miR-130b inhibitors,miR-130b I),分别转染肝癌细胞MHCC97H+和MHCC97L-亚群,从而在肝癌细胞中,上调和/或抑制表达肝癌细胞中miR-130b基因的表达水平,探讨他们对肝癌细胞MHCC97H-CD133+和MHCC97L-CD133-细胞亚群的细胞增殖(MTT法)和细胞周期(流式细胞仪)情况,以及细胞凋亡的情况,迁移(Transwell实验)和侵袭(Transwell实验)能力等,对细胞生物学行为的影响。3.构建mi R-130b慢病毒载体并感染肝癌细胞MHCC97H+和MHCC97L-亚群,以上调表达和或抑制肝癌细胞中的mi R-130b基因的表达水平,并将通过皮下注射,注入裸鼠的体内,观察mi R-130b基因对肝癌细胞增殖能力的影响,并检测与它们相关的信号通路蛋白Notch-Dll1、p53、Bcl-2、SOX2、E2F3、MET、CCND1和Nanog在移植瘤的表达情况。4.mi R-130b的下游靶基因的预测、验证及功能研究:采用PicTar和Target Scan Release 7.1靶基因预测分析的软件,搜索和预测与miR-130b基因可能存在调控关系的靶基因,再综合分析,这两个软件所预测的结果,筛选出与miR-130b基因可能调控的下游靶基因Notch-Dll1。采用荧光素酶报告基因实验,验证miR-130b基因对Notch-Dll1基因起的负调控作用。同时,在肝癌细胞中,构建上调表达或抑制miR-130b基因后,利用qRT-PCR实验和免疫印迹的实验方法(western blotting),测定靶基因Notch-Dll1基因的mRNA水平,和蛋白的表达水平的改变情况。构建抑制Notch-Dll1基因的质粒并转染入MHCC97H+细胞中,通过侵袭(Transwell实验)和迁移(Transwell实验)实验验证下调内源性Notch-Dll1基因能否增强肝癌细胞的侵袭和迁移能力。采用免疫组化实验进一步检测靶基因Notch-Dll1在肝癌组织中表达情况,并分析他们之间的关系。结果1.肝癌组织中miR-130b基因的表达情况:与正常肝组织比较,有转移组与非转移患者的肝癌组织中,miR-130b基因的表达水平,均呈现有一定程度的上调表达,然而,在发生转移的患者的肝癌组织中,miR-130b基因的表达水平,其上调程度更为明显,差别具有显著性意义(P0.05)。2.miR-130b基因的表达水平,影响肝癌临床病理生理生物参数的分析,结果表明:mi R-130b基因表达,与肝癌转移、肿瘤分化程度明显相关(P0.05),而与患者的年龄和性别,肿瘤大小和肿瘤数目及TNM分期均无明显相关(P0.05);而miR-130b基因在肝癌的高表达水平,进一步的分析提示,miR-130b基因对肝癌的预后不良密切相关(P0.01),认为其是影响肝癌患者,对总体生存率的独立风险因素的评估有意义(P0.01),与肝癌预后密切相关。3.上调miR-130b低表达的MHCC97L-亚群细胞在细胞的增殖能力明显增强,UR+LR的凋亡细胞含量百分比明显减少,侵袭迁移能力明显增强,差别具有统计学意义(P0.05);相反,抑制miR-130b高表达的MHCC97H+亚群细胞,其增殖能力明显减弱,UR+LR的凋亡细胞含量百分比明显增多,侵袭迁移能力明显减弱,差别具有统计学意义(P0.05);但上调miR-130b低表达的MHCC97L-或抑制miR-130b高表达的MHCC97H+亚群细胞,可对S+G2期的细胞数量百分比,分别增加或减少,但其差别显示无统计学意义(P0.05)。4.抑制MHCC97H+亚群细胞的miR-130b表达,其移植瘤组织的Notch-Dll1和SOX2、Nanog、E2F3蛋白表达明显高于其他各组细胞,差别具有显著性意义(P0.05);过表达MHCC97L-亚群细胞的mi R-130b表达,其移植瘤组织Notch-Dll1和Bcl-2、CCND1、Nanog、MET蛋白表达明显高于其他各组细胞,差别具有显著性意义(P0.05)。综合两者结果提示,Notch-Dll1和Nanog可能是miR-130b参与肝癌细胞的体外侵袭转移能力的靶蛋白。5.体内试验显示过表达miR-130b的MHCC97H+和MHCC97L-亚群细胞,其肿瘤增殖能力均增强,与对照组相比差别具有显著性意义(P0.05)。6.生物信息学数据的预测结果提示,miR-130b的靶基因可能是Notch-Dll1基因,荧光素酶报告基因的实验证实,mi R-130b基因可以抑制,含有与其存在互补结合位点的萤光报告基因,失去活性。过表达的miR-130b对Notch-Dll1蛋白表达水平,具有负性调节作用。同时,采用siRNA下调Notch-Dll1基因的表达,也能促进肝癌细胞的迁移和侵袭,与miR-130b基因的过表达,有相似的效果。进一步证实了miR-130b基因,是通过转录后水平上调,负性的调控它靶基因Notch-Dll1基因,继而参与肝癌的侵袭和转移的发生。结论1.mi R-130b基因在肝癌组织(尤其是发生转移患者的肝癌组织)中明显表达上调,并与患者的预后密切相关,提示miR-130b基因在肝癌的发生和发展的过程中,起到了类似于促癌基因的作用。2.miR-130b基因极有希望,成为一种肝癌患者新的预后评估的参考指标。3.过表达miR-130b的基因,能促进肝癌细胞体外侵袭和转移能力,以及在体内的增殖能力;反之,抑制miR-130b基因的表达,提示则能降低侵袭转移和增殖能力,提示miR-130b基因在肝癌转移中起重要的调控作用。4.miR-130b基因是通过负性的调节它的靶基因Notch-Dll1的蛋白表达水平,进而可以促进肝癌的侵袭和转移的发生,两者都有望成为治疗肝癌新靶点的潜在可能性。


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