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微小RNA-206靶向缝隙连接蛋白43调控成骨分化在激素性股骨头坏死中的作用研究

刘刚  
【摘要】:研究背景及目的激素性股骨头坏死(steroid-induced avascular necrosis of the femoral head,SANFH)发病机制至今未明,成骨分化障碍与其密切相关。研究表明,微小RNA-206(micro RNA-206,miR-206)可下调其靶蛋白缝隙连接蛋白43(connexin43,Cx43)继而抑制成骨细胞分化,Cx43高表达可激活Wnt经典信号通路,促进成骨细胞分化。而miR-206靶向Cx43调控成骨分化在SANFH中的作用尚未见报道。我们假设Cx43/miR-206通过下游Wnt经典信号通路调控成骨细胞分化在SANFH中发挥重要作用。建立SANFH动物模型,动态检测股骨头内成骨分化相关因子、miR-206、Cx43及Wnt经典信号通路关键蛋白的表达变化,阐明miR-206靶向Cx43调控成骨分化在SANFH中的作用及潜在机制,为SANFH诊疗提供新靶点。方法1、健康新西兰大白兔72只,雌雄各半,应用数字随机法分为模型组和对照组。模型组应用内毒素(lipopolysaccharide,LPS,10mg/kg)联合甲基强的松龙(methylprednisolone,MPS,20mg/kg)建立激素性股骨头坏死模型;对照组于相同时间注射等量生理盐水。两组动物分别于造模后第2、4和8周行核磁共振成像(magnetic resonance imaging,MRI)检查,苏木素-伊红(hematoxylin and eosin,HE)染色确定模型成功建立。2、应用原位杂交(in situ hybridization,ISH)和实时荧光定量聚合酶链反应(real-time-polymerase chain reaction,RT-PCR)检测兔股骨头内miR-206表达,RT-PCR和Westernblot检测Cx43、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、Runt相关转录因子2(Runt-related transcription factor 2,Runx2)、Dickkopf相关蛋白1(dickkopf-related protein 1,Dkk1)、β-连环蛋白(β-catenin),免疫组织化学(immunohistochemistry,IHC)检测Cx43表达。结果1、MRI检查显示模型组兔双侧股骨头T1WI信号强度降低,呈线样或斑点状,T2WI呈不均匀高信号;对照组兔双侧股骨头T1WI和T2WI未见异常信号。光镜观察显示模型组兔股骨头内骨小梁变细,甚至断裂,脂肪细胞增多增大,空骨馅窝增加;对照组兔股骨头内骨小梁结构完整,骨细胞清晰可见,空骨陷窝少见,脂肪细胞相对较少。模型组与对照组空骨陷窝率、脂肪细胞直径比较,差异均有统计学意义(p0.05),模型成功建立。2、ALP染色显示ALP主要阳性表达于骨小梁边缘的成骨细胞,且模型组染色强度较对照组弱;RT-PCR结果显示模型组ALP和Runx2 m RNA表达量较正常组均降低(p0.05),Western blot结果表明Runx2蛋白在模型组兔股骨头内表达较对照组减少(p0.05)。ISH结果显示miR-206阳性表达于髓腔、成骨细胞及少量骨细胞内,且模型组兔股骨头内着色较对照组强。RT-PCR结果表明模型组兔股骨头内miR-206表达较对照组增多(p0.05),且随时间推移有上升趋势。ICH结果显示Cx43阳性表达于髓腔细胞及成骨细胞,且模型组兔股骨头内Cx43染色强度较对照组弱。RT-PCR和Western blot结果表明模型组兔股骨头内Cx43和β-catenin m RNA和蛋白均较对照组表达减少,而Dkk1蛋白和m RNA表达量较对照组明显增多(p0.05)。结论1、应用内毒素联合甲强龙可成功建立兔激素性股骨头坏死模型。2、成骨分化障碍与激素性股骨头坏死密切相关。3、miR-206可能通过下调其靶蛋白Cx43,抑制Wnt/β-catenin信号通路转导,进而抑制成骨分化参与激素性股骨头坏死发生发展进程。


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