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PD-L1在肝细胞癌中的表达和作用研究

钟鉴宏  
【摘要】:前言肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)恶性程度高,预后差。中国属HCC高发区,国内HCC的发病人数约占55%。而且,HCC具有发病因素多样化,死亡率高的特点。肿瘤复发是HCC患者死亡的主要原因。寻找影响HCC复发的风险因素意义重大。发现这些因素,并对其进行干预或治疗是预防术后肿瘤复发进而提高患者总生存率的重要环节。程序性细胞死亡1(Programmed cell death 1,PD-1)是T细胞和激活的B细胞的抑制性受体。作为CD28家族成员之一,这一受体可以与B7家族配体[包括PD-1配体(PD-L1,B7-H1)和PD-L2(B7-DC)]相互作用。这些配体是T细胞关键的攻击分子靶点。目前很多研究报道显示,PD-L1和PD-L2的表达水平与一些癌症患者预后显著相关;另外,已有研究报道了PD-1抗体抑制剂的抗肿瘤效果。然而,PD-L1和PD-L2的表达水平在HCC免疫以及HCC患者临床预后方面,报道结论不统一。另一方面,癌灶和癌旁的适应性免疫细胞参与形成肿瘤免疫微环境。有研究显示,T细胞的亚群细胞(如CD4~+T淋巴细胞和CD8~+细胞毒性T淋巴细胞)浸润程度与结直肠癌患者术后复发率和总生存率相关。在HCC研究领域,PD-L1与CD4~+T淋巴细胞或CD8~+T淋巴细胞结合分析HCC肝切除术后无瘤生存率和总生存率的研究尚未见报道。再者,在HCC的细胞和动物层面,极少研究探讨PD-L1的表达与成瘤性的关系。基于以上研究背景,本研究拟开展荟萃分析,探讨实体瘤癌组织中PD-L1的表达水平与患者预后的相关性,特别是与HCC患者预后的相关性。然后收集我院某个时间段内接受肝切除术治疗的HCC患者临床病理基线数据和预后分析数据,通过病理标本免疫组化分析癌灶、癌旁组织中PD-L1、PD-L2的表达水平,以及CD4~+和CD8~+T淋巴细胞的浸润程度,探讨这些指标与HCC患者临床病理基线数据、预后方面的联系,探索PD-L1、PD-L2、CD4~+和CD8~+T淋巴细胞成为HCC患者预后判断指标的可能性。同时开展基础实验,通过研究上调和下调PD-L1的表达对HCC细胞生物学行为的影响,为进一步体内的机制研究和临床应用提供理论依据。第一部分、PD-L1与实体恶性肿瘤患者预后相关性的荟萃分析目的:程序性死亡配体1(PD-L1)被认为在癌症的免疫逃逸中起关键作用,PD-1/PD-L1的相互作用可以有效抑制体内T细胞的免疫应答,且目前临床上已经有抑制PD-1/PD-L1位点的药物。然而,PD-L1的表达与实体瘤患者预后之间的相关性仍有争议,有必要进行荟萃分析评价PD-L1在实体瘤患者预后的价值。方法:计算机系统检索PubMed、EMBASE等数据库,纳入分析实体瘤患者中PD-L1表达与患者预后相关性的队列研究或病例对照研究。通过点状图和森林图比较PD-L1阳性表达与阴性表达组患者的总生存率差异,同时根据肿瘤类型、人群特征等进行亚组分析。结果:荟萃分析包括了59个研究中的20004例实体瘤患者,实体瘤PD-L1阳性表达率的中位百分数为30.1%。总样本分析显示,PD-L1阳性表达组患者的1、3、5年中位总生存率显著低于PD-L1阴性患者,P值分别为0.039,0.01和0.01;两组患者1、3、5年总生存率的风险比和95%可信区间分别为2.02(1.56-2.60)、1.57(1.34-1.83)和1.43(1.24-1.64)。以种族或肿瘤类型划分的亚组分析显示出了类似的结果。共有7个HCC的研究被纳入分析,1、3、5年总生存率的风险比和95%可信区间分别为1.87(1.01-3.46)、1.40(0.92-2.15)和1.58(1.11-2.25)。结论:目前证据显示,PD-L1阳性表达影响实体瘤患者的预后。然而,PD-L1和预后之间的相关性在不同肿瘤类型中略有不同,尚需开展更多的研究来证实PD-L1的表达在实体瘤患者预后预测和治疗选择中的潜在价值。第二部分、PD-L1/L2和CD4~+/CD8~+T淋巴细胞在HCC组织中的表达/浸润及其与HCC患者预后相关性的研究目的:研究PD-L1/L2和CD4~+/CD8~+T细胞在HCC组织中的表达/浸润程度及其与患者临床特征和预后的关系。方法:qRT-PCR和Western blot检测并比较癌和癌旁PD-L1/L2的表达。免疫组化检测癌组织中PD-L1/L2的表达和CD4~+/CD8~+T淋巴细胞浸润程度,以及其与患者临床特征和预后之间的相关性。结果:PD-L1和PD-L2 mRNA和蛋白的表达水平在HCC组织中显著高于癌旁组织。PD-L1或PD-L2的高表达与多个不良临床病理因素相关,如多结节、Edmondson-Steiner分级III/IV级和BCLC-C期。PD-L1高表达组患者总生存率显著低于低表达组患者(P=0.036),但两组患者在无瘤生存率方面无统计学差异(P=0.095)。PD-L2高表达组患者与低表达组患者在总生存率和无瘤生存率方面均无统计学差异。CD4~+T淋巴细胞高浸润组患者总生存率和无瘤生存率均显著高于低浸润组患者(P=0.015,P=0.038)。CD8~+T淋巴细胞高浸润组患者总生存率和无瘤生存率均显著高于低浸润组患者(P=0.033;P=0.047)。对总样本的多因素分析显示,肿瘤直径≥5cm、多结节、微血管侵犯、包膜不完整、术前甲胎蛋白≥400 ng/ml、术后1月甲胎蛋白≥400 ng/ml、Edmondson-Steiner分级III/IV、BCLC C期肿瘤、肿瘤复发和PD-L1高表达是患者死亡的独立危险因素,而CD4~+T淋巴细胞高浸润、PD-L1和PD-L2同时低表达是患者死亡的保护因素。在无瘤生存率方面,肿瘤直径≥5cm、多结节、微血管侵犯、包膜不完整、术前甲胎蛋白≥400ng/ml、术后1月甲胎蛋白≥400 ng/ml、BCLC C期肿瘤是肿瘤复发的独立危险因素,而PD-L1和PD-L2同时低表达是肿瘤复发的保护因素。Pearson卡方检验发现,PD-L1表达与CD4~+T淋巴细胞浸润存在负相关性(P=0.010)。结论:PD-L1和PD-L2的高表达与多个临床病理因素相关,是HCC患者术后肿瘤复发和患者死亡的危险因素,且CD4~+T淋巴细胞浸润与PD-L1的表达在HCC患者预后方面存在负相关。第三部分、PD-L1在HCC恶性生物学行为中的作用研究目的:在细胞和动物水平研究PD-L1在HCC恶性生物学行为中的作用。方法:首先PCR和Western blot检测四个HCC细胞系(HCCLM3、MHCC97-H、Hep G2和Huh7)中PD-L1的表达,使用PD-L1表达最高的细胞系用于后续实验。然后shRNA下调PD-L1表达,同时构建慢病毒载体上调PD-L1表达,通过裸鼠成瘤实验观察PD-L1表达以及抗PD1/PD-L1治疗对裸鼠成瘤的影响。结果:PCR和Western blot均显示HCCLM3、MHCC97-H、HepG2和Huh7细胞系中有PD-L1表达,但HepG2细胞系的PD-L1表达最高;应用HepG2细胞系的后续实验发现,上调PD-L1表达有利于增强细胞的体外增殖能力和裸鼠成瘤能力;进一步的药物干预实验发现,抗PD-L1治疗有利于降低裸鼠的成瘤速度/肿瘤大小,但对于注射下调PD-L1表达细胞的裸鼠而言,抗PD-L1治疗与否的成瘤速度/肿瘤大小未达统计学差异。结论:HCC细胞系中均表达PD-L1,且PD-L1的表达增强了肿瘤细胞的体外增殖能力和裸鼠成瘤能力,而抗PD-L1治疗则降低了裸鼠成瘤速度。


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