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细菌宏基因组与病毒宏基因组测序的样本处理方法及应用

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【摘要】:伴随着高通量测序技术的优化,其测序通量越来越大,如HiSeq X Ten测序仪,每台机器单次运行可以产生1.8T数据量;测序成本大幅下降,如PGM测序仪单次运行的价格小于1万人民币;测序速率也越来越快,如目前PGM测序仪,单次运行的时间在24h之内;测序质量越来越高,如PGM测序仪可产出约400bp的读长;测序自动化程度也越来越高,如本文中的Miseq测序平台,人工操作平均小于5 h等等。本文以高通量测序平台为基础,对不同的未知病原体感染样本进行宏基因组测序,并且根据样本性质及检测目的不同,对其采取不同的样本处理方法。具体分为以下两个部分:1、建立靶向测序和鸟枪法测序相结合的致病菌筛查方法;2、病毒宏基因组测序的样本处理方法及应用。建立靶向测序和鸟枪法测序相结合的致病菌筛查方法高通量测序技术已越来越多的应用于检测方面,但在筛查部分样本中的细菌真菌原虫时,也有一定的缺陷。因为在病人体内细菌真菌本身滴度就很低,而有些是在经过抗生素治疗的病人,恢复期的病人或者是局部感染细菌真菌而又未入血的病人身上采集的样本,其细菌真菌检出就更加困难。本研究通过建立靶向测序和鸟枪法测序相结合的致病菌筛查方法对样本中的细菌和真菌性病原体进行检测。首先,通过下载已知的细菌序列来验证本实验室设计的分析方法。在计算机模拟分析的四组标本中,相对应的细菌种属的reads检出比例在总细菌reads数中均为最高,证明该分析方法具有可行性。其次,通过已知的四种细菌和三个真菌标本进行实验验证。七个样本中,相对应的种及属的reads检出比例均为标本总reads数的最高,证明该实验方法具有可行性。计算机模拟分析和用已知细菌测试结果表明,利用16S/ITS全长序列扩增产物进行打断建库可以用于细菌和真菌的检测。最后,将该方法应用于临床样本,从临床某患者体内取样得到的脑脊液样本中检测到红球菌和假单胞菌,从同一位患者身上取样得到的血液和唾液中检测到金黄色葡萄球菌。病毒宏基因组测序的样本处理方法及应用近年来,世界范围内出现过很多次以病毒为致病因素导致的大范围新发传染病爆发,如2003年中国爆发的非典型肺炎(SARS);2004年爆发的禽流感席卷了美国和亚洲大部分国家;2014年西非地区爆发的埃博拉病毒导致的疫情等等。在这些情况下,快速检测相关的致病菌就变得非常紧迫。常规的病毒检测,例如病毒的分离培养,血清学检查,形态学检查等等,但是这些常规方法都有一定的不足,比如所需时间长,不能发现未知的病毒等。本研究基于高通量测序,对媒介昆虫样本和临床样本进行检测。在6个蚊虫样本中,有四个样本发现了两种或两种以上的病毒,揭示了媒介昆虫携带病原体种类的多样性。在临床的肺泡灌洗液样本中,采用MDA扩增的方法,发现了一种新型的环状病毒,与目前已知的最接近的PoSCV5-like环状病毒的相似性为89.9%,为疾病的诊断提供了参考依据。综上所述,本文针对不同性质的样本和不同的检测目的,采用不同的样本处理方法,然后使用高通量测序平台对样本进行测序,再探索新的数据分析手段来筛查感染样本的病原体种类,对新发传染病的预防及临床的治疗具有重要意义。


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