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冠突散囊菌发酵液对金黄色葡萄球菌及其生物被膜的作用

覃金球  
【摘要】:金黄色葡萄球菌生物被膜相关感染一直是困扰临床的问题之一,寻找一种可以有效抑制金黄色葡萄球菌及其被膜生长,并且安全无毒的物质对临床预防金黄色葡萄球菌生物被膜的形成及治疗生物被膜相关性感染至关重要。本研究以临床分离的金黄色葡萄球菌为试验菌株,筛选出强产被膜菌株,并建立金黄色葡萄球菌生物被膜体外静置模型,以冠突散囊菌发酵液为研究对象,探讨其对金黄色葡萄球菌及其生物被膜的作用。旨在为寻找治疗金黄色葡萄球菌生物被膜相关感染的新药物提供线索与依据。第一章金黄色葡萄球菌生物被膜形成能力的鉴定及体外模型的建立本部分首先以临床分离的58株金黄色葡萄球菌为试验对象,使用刚果红平板法和结晶紫半定量法对菌株的生物被膜形成能力进行定性及定量分析,再以强产被膜菌株建立生物被膜体外静置模型,通过结晶紫染色试验,扫描电镜及绘制生物被膜形成曲线等多种方式观察生物被膜的形成规律及形态结构。结果显示,58株金黄色葡萄球菌临床分离株生物被膜阳性菌株检出率为51.72%,其中强产被膜菌株为5株,弱生物被膜形成株25株,28株无生物被膜形成;在6孔板中,以盖玻片为载体,可在体外成功培养金黄色葡萄球菌生物被膜模型,强产膜菌株2280在体外培养72小时后可形成成熟的细菌生物被膜,结晶紫染色法观察到成熟的细菌生物被膜呈片状连接,结构紧密,具有一定厚度,菌体间隙较小,扫描电镜下形成成熟生物被膜的菌体大量粘附于载体表面,而胞外基质形成膜状物将细菌包裹于其中。综合分析结晶紫染色法,扫描电镜法及生物被膜生长曲线等结果,我们发现生物被膜的形成过程可大致分为可逆性附着阶段(0-12h),不可逆性黏附阶段(12-24h),彼此黏附形成膜状结构阶段(24-48h),生物被膜成熟阶段(48-72h)及生物被膜播散脱落阶段(72h)等五个时期。第二章冠突散囊菌发酵液对金黄色葡萄球菌的作用本部分使用全自动药敏分析系统测定试验菌株对常用抗菌药物的敏感性,采用纸片扩散法及管蝶法测定发酵液对金黄色葡萄球菌的抑制作用。微量肉汤稀释法及平板法用于测定发酵液及常用抗生素对强产膜金黄色葡萄球菌2280的最低抑菌浓度(MIC)及最低杀菌浓度(MBC)。结果显示,产膜阳性菌株对抗菌药物表现出更高的耐药率,产膜能力的强弱与耐药种类有关,产膜能力越强的菌株其对抗菌药物的耐药种类越多(P=0.008),在5株强产膜金黄色葡萄球菌中,耐药种类6种以上的菌株达4株。纸片扩散法抑菌试验显示除青霉素外,生物膜阳性菌株对克林霉素,阿奇霉素,苯唑西林及发酵液的抑菌圈直径均小于生物膜阴性菌株,差异具有统计学意义。而冠突散囊菌发酵液纸片对金黄色葡萄球菌产膜阳性菌株及产膜阴性菌株的抑菌圈直径分别为8.77mm与11.2mm。管蝶法试验结果显示,发酵液对生物被膜阳性菌株及生物被膜阴性菌株的抑菌圈直径分别为12.87mm与15.72mm。两个体外抑菌试验呈现了相似的结论,冠突散囊菌发酵液在金黄色葡萄球菌临床分离株周围能形成抑菌圈,其对强产膜金黄色葡萄球菌2280的MIC与MBC分别为0.625mg/ml与2.5mg/ml。本部分研究表明发酵液对金黄色葡萄球菌具有一定的抑制作用。第三章冠突散囊菌发酵液对金黄色葡萄球菌生物被膜的作用在强产膜金黄色葡萄球菌2280生物被膜形成的早期阶段及成熟阶段分别加入不同浓度的冠突散囊菌发酵液对其进行干预,并采用结晶紫黏附试验及荧光显微镜等多种方法对干预后生物被膜的情况进行观察。实验结果显示冠突散囊菌发酵液对早期金黄色葡萄球菌生物被膜的形成具有抑制作用,当发酵液浓度大于1MIC时,96孔板内生物被膜的黏附量急剧下降,且发酵液对早期金黄色葡萄球菌生物被膜的抑制效果随着发酵液浓度的升高而升高,当发酵液浓度达4MIC时,盖玻片载体表面基本无细菌生物被膜形成。对于已成熟的金黄色葡萄球菌生物被膜,发酵液的清除作用不明显,荧光图片显示随着加入的发酵液浓度不断增大(1/4MIC~16MIC),生物被膜内死菌数量逐渐增多,药物浓度达到16MIC时,虽然有大量的菌体死亡,但大部分生物被膜结构仍然保持完整。试验结果提示在金黄色葡萄球菌生物被膜形成的早期阶段添加高浓度的冠突散囊菌发酵液能对生物被膜达到最佳抑制效果,冠突散囊菌发酵液代谢产物具有开发成为治疗金黄色葡萄球菌感染药物的应用潜力。本研究初步探讨了冠突散囊菌发酵液对金黄色葡萄球菌及其生物被膜的作用,为冠突散囊菌发酵液治疗金黄色葡萄球菌感染提供了理论依据,同时为冠突散囊菌在医药学领域的应用开发提供了新思路。


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