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胰腺癌腹水小鼠动物模型的建立及抗IL-9抗体对小鼠胰腺癌腹水的作用研究

卢东诚  
【摘要】:胰腺癌恶性程度高,据预测未来十年,胰腺癌的死亡率逐年上升。胰腺癌易发生早期转移,多数胰腺癌病人就诊时已发生远处转移,其中多转移至腹膜产生腹水、肠梗阻等并发症,胰腺癌腹水的产生将增加患者身体负荷,因此胰腺癌腹水的产生机制和治疗方法成为目前迫切需要解决的难题。恶性腹水(malignant ascites,MA)中含大量免疫因子和免疫细胞,这些免疫因子和免疫细胞在恶性腹水的发生、发展及转归过程中发挥着极其重要的作用。白细胞介素9(IL-9)是具有多重作用的免疫效应因子,具有促炎和抗炎,或促瘤和抑瘤的双重作用,是近年的研究热点和难点。本课题组前期研究发现,与肝硬化腹水相比,肝癌患者腹水中IL-9水平升高,且肝癌患者腹水中的IL-9水平越高,患者生存时间越短,我们课题组的前期研究还发现IL-9能够促进肝癌细胞和胰腺癌细胞的迁移和侵袭,使用抗IL-9抗体中和小鼠肝癌腹水中的IL-9能使小鼠生存时间延长。虽然在人肝癌腹水和小鼠肝癌腹水中IL-9水平升高,但是IL-9在胰腺癌腹水中的水平尚未可知,因此,为了能够了解IL-9与胰腺癌腹水的关系以及进一步阐明胰腺癌腹水的发病机制、发生发展和预后转归,建立一种适宜的胰腺癌腹水小鼠动物模型是非常有必要的。胰腺癌腹水中的IL-9水平怎样?IL-9是否可以作为胰腺癌腹水的免疫干预治疗靶点呢?为探索上述问题,我们将通过建立胰腺癌腹水小鼠动物模型并检测模型小鼠外周血和腹水中的IL-9水平,以及干预小鼠动物模型两方面进行研究。第一部分胰腺癌腹水小鼠动物模型的建立目的:胰腺癌恶性程度高,易侵袭转移至腹腔产生腹水,严重影响病人的生活质量及生存时间,因此建立一种合适的胰腺癌腹水小鼠动物模型显得尤为重要,可以为阐明胰腺癌腹水的发病机制、诊断及治疗提供合适的工具。方法:采用Panc02细胞系(G0)腹腔注射C57BL/6小鼠出现腹水,第一批注射Panc02细胞系的小鼠命名为g1。然后从g1中抽取腹水并重新注入新的小鼠腹腔,命名为g2,这样一直循环直到g10。比较g1,g5和g10小鼠中出现腹水的比例、腹水量和小鼠的生存时间。将g1,g5和g10小鼠腹水中的胰腺癌细胞进行分离提纯并体外培养,分别命名为G1,G5和G10。将G0、G1、G5、G10细胞分别按5×10~5,1×10~6,2×10~6和5×10~6的细胞量分四组(每组5只)注射新的小鼠,以筛选出用于建立动物模型的最佳细胞量。通过苏木精-伊红(HE)染色和透射电子显微镜(TEM)检测比较G0,G1,G5和G10胰腺癌细胞之间的形态学变化。通过划痕实验和Transwell小室实验比较G0,G1,G5和G10胰腺癌细胞的迁移和侵袭能力。ELISA法测定正常对照小鼠血浆中的IL-9水平,以及g1,g5和g10胰腺癌腹水小鼠血浆和腹水中的IL-9水平。结果:腹水经过小鼠间传代,模型小鼠出现腹水的比例、腹水量逐渐增加,生存时间逐渐减少,至g5小鼠时逐渐稳定;经过筛选,1×10~6个G1胰腺癌细胞为最佳建立模型细胞量。细胞形态学表现及划痕实验、Transwell小室实验结果显示,与G0胰腺癌细胞相比,G1、G5、G10胰腺癌细胞迁移、侵袭能力逐渐增强。ELISA实验结果提示腹水模型小鼠血浆中IL-9水平较正常对照小鼠升高,模型小鼠腹水中的IL-9水平随着传代次数的增加逐渐升高,且IL-9升高水平与小鼠生存时间呈负相关。结论:1×10~6个G1胰腺癌细胞小鼠腹腔注射为最佳的胰腺癌腹水小鼠动物模型建立方法。IL-9可能对胰腺癌腹水的发生发展起促进作用。第二部分抗IL-9抗体对小鼠胰腺癌腹水的作用研究目的:测定胰腺癌腹水模型小鼠腹水中的IL-9、VEGF和MMP-2水平,探索抗IL-9抗体治疗小鼠胰腺癌腹水的作用及其机制,阐明IL-9在胰腺癌腹水中的作用。方法:应用第一部分实验中G1胰腺癌细胞建立胰腺癌腹水小鼠动物模型,建立模型24小时后将15只小鼠随机分为10μg组,20μg组,30μg组,每组5只,分别给予10μg,20μg和30μg抗IL-9抗体腹腔注射,隔天给药1次,共5次,末次给药结束24小时后处死小鼠,检测各组小鼠腹水中的IL-9浓度,筛选出最佳抗IL-9抗体干预浓度。同样方法继续造模45只小鼠,随机分为空白对照组、阴性对照组和实验组,每组15只。实验组小鼠给予腹腔注射20μg抗IL-9抗体,阴性对照组小鼠给予腹腔注射20μg同型对照IgG抗体,空白对照组小鼠给予腹腔注射等体积生理盐水,每只小鼠注射药物体积均为0.2ml,隔天给药1次,共给药5次。末次给药结束24小时后,每组随机处死10只小鼠,采集小鼠腹水,测量腹水体积,收集腹水上清,采用ELISA法检测腹水中的IL-9、VEGF?MMP-2水平,剩余小鼠观察生存时间。结果:干预后空白对照组、阴性对照组和实验组小鼠的腹水体积分别为(2.87±0.20)ml、(2.88±0.25)ml、(2.17±0.35)ml,与空白对照组以及阴性对照组相比较,实验组小鼠的腹水体积明显减少,差异具有统计学意义(P0.05)。空白对照组、阴性对照组以及实验组小鼠的平均生存时间分别为(13±2)天、(12.8±1.79)天、(15.6±1.14)天。实验组小鼠的生存时间显著长于阴性对照组和空白对照组,差异具有统计学意义(P0.05)。比较各组小鼠腹水中的IL-9、VEGF和MMP-2表达水平,研究结果显示:与空白对照组及阴性对照组相比较,实验组小鼠腹水中的IL-9水平明显降低,差异具有统计学意义(P0.05);与空白对照组及阴性对照组相比较,实验组小鼠腹水中的VEGF水平明显降低,差异具有统计学意义(P0.05);但三组小鼠腹水中的MMP-2水平相比较无明显变化,差异无统计学意义(P0.05)。结论:抗IL-9抗体可以有效抑制小鼠胰腺癌腹水的产生,延长小鼠的生存时间。抗IL-9抗体抑制小鼠胰腺癌腹水的机制可能是通过抑制腹水中VEGF的表达来实现的。


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