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基于P70S6K1靶点研究索拉非尼耐药性肝癌细胞的分子机制

刘美珍  
【摘要】:目的:为了探索p70S6K1是否参与肝细胞癌对索拉菲尼的耐药,以及探讨索拉菲尼诱导耐药后p70S6K1对肝癌细胞的分子作用机制,从而明确p70S6K1作为耐药性肝癌的潜在治疗靶标,丰富肝癌治疗手段。方法:1、收集了肝癌患者手术标本及病例资料92例,分析其临床生化检验指标以及选取其中20例经10%福尔马林固定、取材、包埋、制片后,经常规HE染色后选取典型蜡块,应用免疫组织化学染色检测耐药性肝细胞内源性p70S6K1,TOPO II,TP53,Ki-67蛋白表达的变化,另外进一步利用RT-PCR检测耐药性肝细胞内源性p70S6K1mRNAs水平在肝癌及癌旁组织种的表达。2、构建索拉菲尼耐药HepG2细胞株,采用荧光定量PCR检测索拉菲尼耐药HepG2细胞内p70S6K1mRNAs水平在肝癌及癌旁组织种的表达。进而进一步运用CCK8细胞增殖法和免疫荧光染色法探讨细胞生长与增殖状况,进而评价耐药性对细胞存活的影响。3、应用shRNA技术构建索拉菲尼耐药HepG2细胞株p70S6K1敲低模型,通过转染后克隆实验进一步验证p70S6K1对耐药性肝癌细胞增殖作用。然后通过免疫荧光检测p70S6K1敲低及对照组中耐药蛋白PGP及靶标蛋白p70S6K1、mTOR、MDM2的表达特性,以此寻找p70S6K1在索拉菲尼耐药肝癌细胞发挥作用所涉及的作用机制。结果:1、与非癌组织样品比较,索拉菲尼耐药性肝癌标本细胞内p70S6K1,特异性耐药蛋白TOPO II和增殖蛋白Ki-67蛋白表达明显上调,而TP53水平减少。其中细胞内p70S6K1定位/定量蛋白表达与定量p70S6K1 mRNA上调结果相一致。2、CCK-8结果和免疫荧光染色显示,PCNA细胞增殖蛋白在耐药性肝癌细胞中表达增加,且呈一定时间依赖关系。此外,与对照比较,索拉菲尼耐药的肝癌细胞内PGP耐药蛋白显著增加,具有时间依赖性;荧光定量PCR结果显示,索拉菲尼耐药的肝癌细胞内有p70S6K1mRNA含量明显上调。3、转染后克隆实验数据发现,shRNA特异性敲低p70S6K1后耐药性肝癌细胞菌群数明显减少及细胞生长受阻;同时,耐药性肝癌细胞敲低p70S6K1后,内源性PCNA蛋白表达明显减少;此外,免疫荧光染色分析显示,敲低p70S6K1后耐药性肝癌细胞内PGP,mTOR,MDM2等蛋白表达显著下调。结论:1、p70S6K1在索拉菲尼耐药肝癌组织及细胞中是高表达的;2、敲低p70S6K1可以增加肝癌细胞对索拉菲尼的敏感性;3、揭示p70S6K1通过激活mTOR/MDM2通路负调控TP53,进而诱导索拉菲尼耐药的分子机制。


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