抗人erbB2人/鼠嵌合抗体的构建、真核高效表达及治疗卵巢癌的实验研究

【摘要】： 卵巢癌死亡率在妇科肿瘤中居首位。尽管肿瘤减灭术及以铂类为基础的联合化疗在卵巢癌的治疗中起到了积极的作用，但因缺乏有效的早期诊断方法，70％的患者初诊时即为晚期患者。手术及化疗后复发率高、易出现耐药，因而患者的5年生存率长期停留在30％左右。erbB2在相当部份的卵巢癌中有过度表达，并与患者预后不良，复发、耐药有关，开展针对erbB2抗原的免疫治疗为卵巢癌治疗提供了一种新的手段。因此，本课题首先探讨了C-erbB2、C-erbB3、C-erbB4的表达与卵巢恶性肿瘤发生、发展、转移及其预后价值；研制了抗erbB2人鼠嵌合抗体HZC26并进行了真核高效表达；在此基础上利用HZC26进行了治疗erbB2过表达的卵巢癌的体、内外实验研究。 C-erbB2、C-erbB3、C-erbB4的表达与卵巢恶性肿瘤的关系 采用SABC免疫组织化学方法检测了49例卵巢恶性肿瘤、21例良性肿瘤及19例正常卵巢肿瘤组织中C-erbB2、C-erbB3、C-erbB4的蛋白表达，结果显示：卵巢恶性肿瘤组织中C-erbB2、C-erbB3、C-erbB4表达率显著高于良性肿瘤及正常卵巢，相比较差异有显著性(p＜0.05)。在卵巢恶性肿瘤中，C-erbB2、C-erbB3、C-erbB4的表达与肿瘤的临床分期有关，但与病理学类型、组织分化程度无关。这些结果表明，C-erbB2、C-erbB3、C-erbB4的表达与卵巢恶性肿瘤的发生、发展有关。大量腹水者C-erbB2、C-erbB3、C-erbB4的表达明显高于无或少量腹水者，C-erbB2、C-erbB4在术后残存灶＞2cm的表达明显高于无残存灶者，淋巴结阳性患者C-erbB2的表达明显高于淋巴结阴性患者。C-erbB2、C-erbB3、C-erbB4在大网膜转移患者中的表达率均明显高于大网膜正常者。C-erbB2、C-erbB4在有远处转移患者中的表达率明显高于无远处转移者。提示C-erbB2、C-erbB3、C-erbB4的表达与恶性肿瘤的浸润转移有关。采用单因素及Cox模型综合分析证实：残存瘤的大小、C-erbB2、C-erbB4是影响卵巢癌预后的最重要的因素。 抗erbB2人鼠嵌合抗体HZC26的构建及真核高效表达 鼠单抗应用于人体治疗引起人抗鼠抗体反应，减弱或抵消其疗效，将鼠单抗改造为人／鼠嵌合抗体能降低甚至消除HAMA反应。嵌合抗体临床试用的大量研究表明，它疗效好，免疫原性与其它人源化抗体相似，而亲和力常常高于其它人源化抗体。因此，本研究采 用基因工程技术将鼠单抗改造为人鼠嵌合抗体。应用RT－PCR的方法 扩增鼠单抗ZC26的轻、重链可变区基因，克隆入含有人轻、重链恒 定区完整基因组序列和弱化启动子驱动的选择标志基因的真核高效 表达载体中。经核昔酸序列测定鉴定鼠单抗氨基酸序列正确后，转 染CHO－dhfr“细胞后经G418筛选、亚克隆和数轮的MTX加压、亚克 隆筛选获得稳定、高产量表达抗erbBZ 人鼠嵌合抗体的细胞株 CHO－HZC26，目前在 IX 10－’mollL的 MTX力压的条件下，抗体产 量已达120ug／m！。 抗erbBZ人鼠嵌合抗体HZC26治疗 卵巢癌的实验研究 将嵌合抗体HZC26纯化后，经直接ELISA、竞争抑制ELISA、 细胞ELISA、RTICR、Western七lot等方法证实，本研究所高效表达 的嵌合抗体HZC26确实为可与erbBZ特异结合，并具有人IgGI抗体轻、 重链恒定区的抗erbBZ嵌合抗体。体外实验表明：HZC26可特异的抑制 erbBZ过表达的卵巢癌细胞SKOV3 的增殖，同时利用流式细胞仪研 究了HZC26对SKOV3细胞周期的作用，发现HZC26可以导致SKOV3 细胞的GI期阻滞。在体外与顺铂联合应用对卵巢癌细胞增殖的抑制 具有协同作用，与阿霉素则产生相加效应。应用HZC26嵌合抗体对 人卵巢癌裸鼠移植瘤的体内治疗实验显示：HZC26在体内也具有抑制 卵巢癌细胞增殖的作用，与顺铂联合应用可显著提高）l匝铂的抑瘤效 果，对顺铂化疗具有增敏作用。 综上所述：本研究证实了C－erbBZ、C－erbB4均可作为卵巢癌的独 立预后因素，成功构建并在真核细胞中高效表达了抗erbBZ人鼠嵌合 抗体，体内外实验证该嵌合抗体可特异的抑制erbBZ过表达的卵巢癌 细胞SKOV3 的增殖并对顺铂化疗具有增敏作用。有望为我国治疗卵 巢癌提供一种新的有效的手段和药物。