收藏本站
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

短尾蝮蛇毒磷脂结合抗凝蛋白的生物化学、药理学和分子生物学的研究

黎渊弘  
【摘要】: 目的蛇毒是一种含有多种蛋白和多肽的混合物,其中不少毒性蛋白影响凝血功能(血液凝固、纤溶系统和血小板聚集),这些毒素是蛋白质或酶。如L-氨基酸氧化酶、磷脂酶A、核苷酸酶、类凝血酶、纤溶酶、蛋白酶C;而有些是非酶蛋白,如解离素、Carinatin、Trigramin。它们的各种有效成分和性质也被广泛研究。然而,蛇毒中所含磷脂结合抗凝蛋白的研究尚未见报道。本课题的目的旨在从短尾蝮蛇毒中分离纯化出磷脂结合抗凝蛋白(Phospholipid-binding anticoagulation protein(PBAP),并对它的一些生化、物理性质;对动物体内外的抗凝血、抗血栓、血液流变学作用;一般药理和毒理;作用机制以及基因克隆进行研究。从而通过生物学的方法得到电泳纯、有活性的磷脂结合抗凝蛋白,为制备安全、有效的新型溶栓制品打下良好的基础。 1方法 1.1短尾蝮蛇毒磷脂结合抗凝蛋白的纯化和鉴定:采用阳离子交换剂CM-Sephadex C-25、阴离子交换剂DEAE-Sepharose CL-6B,凝胶过滤剂Sephacryl S-200、Sephadex G-75层析的方法进行分离和纯化磷脂结合抗凝蛋白:用活化的部分凝血活酶时间(APTT)测定其抗凝活性;以专一性酶测定方法测定其酶活性;用SDS-PAGE电泳检测其蛋白相对分子质量;用等点聚焦测定其蛋白等电点;用Dittmer's的簿层层析方法测定抗凝蛋白与磷脂结合;采用Edman降解法测定其氨基酸序列。 1.2短尾蝮蛇蛇毒磷脂结合抗凝蛋白体内外对凝血功能的影响: 1.2.1活化的部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶原时间(PT)、凝血酶时间(TT)、纤维蛋白原(FIB)含量测定 1.2.1.1体外法:0.2 mg/ml的磷脂结合抗凝蛋白0.1ml,分别与1、2、4、6、8ml正常人混合血浆配置成1:10、1:20、1:40、1:60、1:80不同稀释浓度,每一稀释浓度取0.05ml,然后按APTT、PT、TT、FIB试剂盒说明,在美国IL公司ACL-Advace全自动血凝仪上进行。 1.2.1.2体内法:新西兰白兔24只,随机分为磷脂结合抗凝蛋白高、中、低剂量组和肝素组。各兔于耳缘静脉按0.8、0.4、0.2 mg/kg给药,肝素组剂量为50U/kg,药前及药后15min分别从耳动脉取血2ml,用3.8%枸橼酸钠9:1抗凝,3000转/ml离心10min,分离贫血小板血浆,按APTT、PT、TT试剂盒说明,在美国IL公司ACL-Advace全自动血凝仪上进行测定。 1.2.2凝血因子活性的测定 1.2.2.1体外法:0.2 mg/ml的磷脂结合抗凝蛋白0.1ml,分别与1、2、4、6、8ml正常人混合血浆配置成1:10、1:20、1:40、1:60、1:80不同稀释浓度,每一稀释浓度取0.05ml,用因子缺乏血浆作为标准,按Triplett建立的方法进行凝血因子FⅡ:C;FⅤ:C;FⅦ:C;FⅧ:C;FⅨ:C;FⅩ:C;FⅪ:C;FⅫ:C的活性测定,并计算抑制率。 1.2.2.2体内法:新西兰白兔24只,随机分为磷脂结合抗凝蛋白高、中、低剂量组和肝素组。各兔于耳缘静脉按0.8、0.4、0.2 mg/kg给药,肝素组剂量为50U/kg,药前及药后15min分别从耳动脉取血2ml,用3.8%枸橼酸钠9:1抗凝,3000转/ml离心10min,分离贫血小板血浆,按凝血因子试剂盒说明,在美国IL公司ACL-Advace全自动血凝仪上进行各凝血因子测定。 1.3短尾蝮蛇毒磷脂结合抗凝蛋白体内外对动物血栓的抗栓作用:用Chandler法制备家兔体外血栓和半体内血栓模型;用Reyers法制备大鼠静脉血栓模型;用Nowork法制备家兔肺动脉栓塞模型。测定磷脂结合抗凝蛋白对家兔体外血栓;半体内血栓;肺动脉栓塞和大白鼠静脉血栓的抗栓效应。 1.4短尾蝮蛇毒磷脂结合抗凝蛋白对动物血液流变学的影响:采用LBY-N6A自清洗旋转式粘度计测量家兔全血黏度、红细胞压积等指标。 1.5短尾蝮蛇毒磷脂结合抗凝蛋白的一般药理作用: 1.5.1小鼠尾静脉注射磷脂结合抗凝蛋白(0.4mg/kg)后观察其一般行为、协调活动和对阈下戊巴比妥钠的催眠作用。 1.5.2家兔静脉注射磷脂结合抗凝蛋白(0.4mg/kg)后,观察家兔的心率、心电图、平均动脉压、呼吸频率等指标。 1.6短尾蝮蛇毒中磷脂结合抗凝蛋白对小鼠的急性毒性实验:用Bliss方法计算静脉注射和腹腔注射两种给药途径的LD_(50)及95%的可信限。 1.7短尾蝮蛇毒磷脂结合抗凝蛋白的基因克隆和序列分析:从蝮蛇的毒腺中抽提总RNA,采用RT-PCR技术,用TaKaRa RNA PCR Kit(AMV)Ver 3.0试剂盒扩增DNA片段,将PCR扩增产物克隆至原核载体PMD-19T载体,转化大肠杆菌JM109,挑选白色菌落提取质粒,用PCR对其进行鉴定,直接利用纯化PCR产物和提取阳性菌落质粒进行测序。 2结果 2.1采用离子交换、凝胶过滤等方法从短尾蝮蛇中分离纯化出的抗凝蛋白是二聚体,相对分子质量为24.0×10~3(非还原)和14.6×10~3(还原)。酸性氨基酸(天冬门氨酸,谷氨酸)的含量大于碱性氨基酸。等电点为pH 5.2。得率约占蛇毒总重量的0.421%。该蛋白具有精氨酸酯酶活性,能明显地延长活化的部分凝血活酶时间(APTT),抗凝活性在pH 6-9的范围内稳定。氨基酸N-末端序列由D-C-P-S-(D/G)-W-S-S-Y-E-G-H-C-Y-(Q/K)两条肽链组成。能够与磷脂结合,称为磷脂结合抗凝蛋白。 2.2磷脂结合抗凝蛋白体内外有明显的抗凝血作用。 2.2.1磷脂结合抗凝蛋白体内外能显著地延长APTT:0.2mg/ml的抗凝蛋白与30份正常人血浆以1:80、1:60、1:40三种不同浓度稀释,每一稀释浓度取50μl进行试验,结果表明:三种浓度抗凝蛋白体外对APPT的影响分别为57.54±2.66、74.77±7.18、107.92±11.4秒与对照组37.43±2.03秒相比有显著性差异(P<0.01),抗凝蛋白浓度越高,其抗凝活性越强。这种作用与温育时间无关。家兔体内抗凝试验也表明:0.8、0.4、0.2mg/kg大中小剂量的磷脂结合抗凝蛋白药后15min的APTT为116.94±38.19、87.27±7.13、76.07±11.66秒,均比药前的53.82±1.96、54.77±5.75、57.95±12.24秒明显延长(P<0.01或0.05),且有剂量依赖性,中等剂量抗凝蛋白对APPT的作用与50U/kg肝素相似。它不影响凝血酶原时间(PT)和凝血酶时间(TT)。 2.2.2在TTI抑制试验中,当抗凝蛋白为4.4μg/mL浓度时,在APPT试剂为1:100和1:1000稀释时,APPT分别为54.7秒(对照48.7秒)和176.8秒(对照137.7秒)表明用高稀释度的APPT试剂时,减少TTI试剂的磷脂浓度,能加速其抗凝作用。在稀释的罗氏蝰蛇毒时间测定中,亦可看到在抗凝蛋白浓度为2.2μg/mL和4.4μg/mL正常混合血浆时,罗氏蝰蛇毒时间分别为47.7秒和56.5秒(对照41.5秒),表明在抗凝蛋白的作用下,稀释的罗氏蝰蛇毒时间较对照(41.5秒)明显延长,而且与剂量成正比。其抗凝活性与磷脂结合有关。 2.2.3磷脂结合抗凝蛋白干扰凝血因子Ⅷ、Ⅸ、Ⅺ、Ⅻ因子活性体外凝血因子试验表明:1:60和1:80稀释度仅抑制FⅨ:C因子活性,1:10、1:20、1:40稀释度则可抑制FⅧ:C、FⅨ:C、FⅪ:C、FⅫ:C的活性。兔体内凝血因子试验也表明:0.8、0.4mg/kg两剂量磷脂结合抗凝蛋白药后15min均可抑制FⅧ:C、FⅨ:C、FⅪ:C、FⅫ:C的活性,抗凝蛋白浓度与因子抑制活性呈正相关。 2.3磷脂结合抗凝蛋白对家兔体外血栓;半体内血栓;肺动脉栓塞和大白鼠静脉血栓均有明显的抗栓效应 2.3.1磷脂结合抗凝蛋白对家兔体外血栓模型有明显的抗栓效应:0.62mg/ml磷脂结合抗凝蛋白50、30、10μl可使家兔体外血栓的干重由对照组的23.7±2.1mg减轻至0±0,15.4±2.2,18.54±1.9mg(P<0.01。湿重由对照组132.7±10.5 mg减轻至0±0,72.9±12.3,96.4±12.1mg(P<0.01)。 2.3.2磷脂结合抗凝蛋白对家兔半体内血栓模型有明显的抗栓效应:磷脂结合抗凝蛋白0.8、0.4、0.2mg/kg各剂量组药后5、15、30、45min与药前组比较,各剂量组血栓的干、湿重量均比药前组减轻(P<0.01-0.05)。其中以5min减轻最明显。 2.3.3磷脂结合抗凝蛋白对大鼠静脉血栓有明显的抑制效应:生理盐水组血栓形成率均为100%,磷脂结合抗凝蛋白组(0.8mg/kg)大鼠静脉血栓形成率均为0%,差异显著(P<0.01)。 2.3.4磷脂结合抗凝蛋白对家兔肺动脉栓塞有明显的抗栓作用:与对照组相比,给药组(0.4mg/kg)药后24h栓子减少32.26±2.23mg,对照组给生理盐水后24h栓子减少4.46±0.55mg两者比较有显著性差异(P<0.01)。 2.4短尾蝮蛇毒磷脂结合抗凝蛋白具有明显降低家兔血液流变的作用:0.4mg/kg磷脂结合抗凝蛋白静脉注射于家兔后与阴性对照组相比,低切、中切、高切变率下家兔的全血粘度分别降低0.91±0.31、0.51±0.11和0.39±0.08(p<0.05而红细胞压积显著降低4.00±1.41%(P<0.01)。 2.5短尾蝮蛇毒磷脂结合抗凝蛋白的一般药理学研究表明:小鼠尾静脉注射磷脂结合抗凝蛋白(0.4mg/kg)后,磷脂结合抗凝蛋白对小鼠的一般行为、协调活动和对阈下戊巴比妥钠的催眠作用以及各组剂量磷脂结合抗凝蛋白对家兔的心率、心电图、血压以及呼吸频率等均无影响。 2.6短尾蝮蛇毒中磷脂结合抗凝蛋白对小鼠的急性毒性实验:小鼠静脉注射磷脂结合抗凝蛋白的LD_(50)为26.869mg/kg,95%平均可信限23.348~0.65mg/kg,腹腔注射磷脂结合抗凝蛋白的LD_(50)为39.897mg/kg,95%平均可信限35.948~44.128mg/kg。 2.7短尾蝮蛇毒磷脂结合抗凝蛋白的基因克隆和序列分析:引物扩增得到一条特异性的DNA条带,大小为400 bp,将其进行克隆及测序,序列分析结果显示我们所得到的cDNA长599bp,其中编码框有441bp,编码由146个氨基酸组成的磷脂结合抗凝蛋白前体。其前体N端由23个氨基酸组成信号肽,由123个氨基酸构成的成熟磷脂结合抗凝蛋白质。 3结论 从短尾蝮蛇毒中分离纯化出的磷脂结合抗凝蛋白是二聚体,相对分子质量为24.0×10~3(非还原)和14.6×10~3(还原)。等电点为pH 5.2。得率约占蛇毒总重量的0.421%。该蛋白具有精氨酸酯酶活性,能够与磷酯结合。能显著地延长活化部分凝血活酶时间和稀释的罗氏蝰蛇毒时间,减少组织凝血酶抑制试验(TTI)试剂的磷脂浓度,能加速其抗凝作用,它干扰Ⅷ、Ⅸ、Ⅺ、Ⅻ因子活性,可能通过内源性途径抑制凝血过程。它明显降低家兔全血粘度和红细胞压积。对家兔体外血栓;半体内血栓;肺动脉栓塞和大白鼠静脉血栓具有明显的抗栓作用。它不影响实验动物的神经系统、循环系统和呼吸系统,毒性低、无溶血、无出血活性。 通过基因克隆和序列分析表明:它与已报道的一些蛇毒凝集素氨基酸序列相比较,有88%-99%的同源性。该蛋白具有潜在的临床应用价值。


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前20条
1 张志强,李元培,张东菊,王江川,黄繁嫱,刘丽;缺血性脑卒中时血浆抗凝蛋白活性的改变[J];中华血液学杂志;1999年03期
2 魏孟广,许培钦;布-加综合征患者血浆抗凝蛋白测定[J];河南医学研究;2005年02期
3 周立红,刘敏涓,刘泽霖,董临江;肝硬化患者血浆凝血—抗凝系统的研究[J];临床消化病杂志;2003年03期
4 白春梅!100730,潘家绮!100730,范连凯!100730,王书杰!100730;静脉血栓患者抗凝蛋白缺陷研究[J];中华内科杂志;2000年11期
5 顾健,张育,赵广圣,汪中强,孙爱红,朱新华,马莉,鹿群先;血栓性疾病患者抗凝蛋白的测定及凝血酶原基因G20210A变异[J];中华血液学杂志;2003年11期
6 姜利,王辰,庞宝森,代华平,黄克武;急性肺损伤抗凝蛋白的变化及肝素对急性肺损伤保护作用的实验研究[J];中华结核和呼吸杂志;2003年10期
7 芦璐,房淑欣,高阳;下肢深静脉血栓形成患者抗凝蛋白缺陷的临床研究[J];医师进修杂志;2005年19期
8 黎渊弘;罗艳萍;廖共山;;短尾蝮蛇毒磷脂结合抗凝蛋白的酶学性质研究[J];重庆医科大学学报;2010年11期
9 芦琳;王秀丽;;下肢深静脉血栓形成患者抗凝蛋白缺陷的临床研究[J];中国临床医学;2005年06期
10 钟小斌;黎渊弘;吴国才;黎肇炎;;短尾蝮蛇毒磷脂结合抗凝蛋白多克隆抗体制备及其免疫学特性鉴定[J];广西医科大学学报;2009年01期
11 朱莉;张玫琦;张晶;;获得性易栓症临床研究现状[J];吉林医学;2008年21期
12 袁辉,华子春,邓海兰;重组人胎盘抗凝蛋白变体基因工程表达菌的表达条件优化研究[J];东南大学学报(医学版);2004年04期
13 赵永强;;易栓症研究概况[J];中国实用内科杂志;2007年01期
14 鞠成伟,王连生,杨翔,马根山,华子春,高兴亚;人胎盘抗凝蛋白变体的抗凝与抗栓作用[J];中华血液学杂志;2004年09期
15 房淑欣,欧东仁,芦璐;下肢深静脉血栓形成与抗凝蛋白的关系研究[J];中国交通医学杂志;2005年03期
16 陈昀,纪春岩,朱媛媛,郭农建;深静脉血栓患者抗凝与纤溶功能研究[J];临床血液学杂志;2004年06期
17 黄东萍,黎肇炎,杨斌,韦世秀,林发全,韦乃球;人胎盘抗凝蛋白的分离纯化及鉴定[J];中国药理学通报;2004年04期
18 马水清,白春梅,盖铭英;遗传性易栓症与流产[J];中华妇产科杂志;2001年11期
19 杨斌,黎肇炎,陈美芳,班建东,黄君度,林发全;蝮蛇毒中类狼疮抗凝蛋白体内抗凝作用的研究[J];广西医科大学学报;2000年02期
20 王金良;现代检验诊断新技术(三十六) 体内血栓前状态和血栓的检验[J];开卷有益.求医问药;2004年12期
中国重要会议论文全文数据库 前3条
1 陈昀;郭农建;纪春岩;朱媛媛;;深静脉血栓患者抗凝与纤溶功能研究[A];中华医学会第八次全国血液学学术会议论文汇编[C];2004年
2 贺石林;;弥散性血管内凝血的研究进展[A];第十一次全国中西医结合儿科学术会议论文汇编[C];2004年
3 王明山;王霄霞;徐斐;陈晓东;陶志华;;狼疮样抗凝物质对肺血栓栓塞的影响[A];2004年浙江省检验医学学术会议论文汇编[C];2004年
中国博士学位论文全文数据库 前3条
1 华宝来;凝血系统活化与脑梗死高危分层探讨[D];中国协和医科大学;2005年
2 罗婷婷;我国重型血友病患者临床表现异质性与抗凝蛋白缺乏的关系研究[D];北京协和医学院;2009年
3 丁卢胤;重型血友病临床表现异质性与抗凝蛋白及纤溶相关蛋白的关系[D];北京协和医学院;2010年
中国硕士学位论文全文数据库 前3条
1 黄东萍;人胎盘抗凝蛋白的分离纯化及其体外抗凝作用研究[D];广西医科大学;2003年
2 黄海英;僵蚕抗凝活性成分的提取与纯化[D];湖南中医学院;2004年
3 郭文茹;一个遗传性蛋白C缺陷家系蛋白C表型和基因型研究[D];天津医科大学;2002年
中国重要报纸全文数据库 前1条
1 牛严;让癌细胞“改邪归正”[N];大众科技报;2001年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978