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DNA甲基化检测方法的建立和广西巴马县人群白细胞DNA总体甲基化水平研究

李春宏  
【摘要】: DNA甲基化是指在DNA甲基化转移酶的催化下,使S-腺苷甲硫氨酸分子上的甲基基团转移至胞嘧啶环第五位碳原子上,形成5-甲基胞嘧啶的过程,它能够在不改变基因组中碱基排序的前提下影响基因转录和表达,在衰老、肿瘤、遗传病、自身免疫性疾病的发生发展中起着重要的调节作用,因此甲基化与疾病相关的研究成为近二十多年来分子流行病学领域的研究热点。为了适应甲基化研究的发展,需要建立用于检测基因组总体甲基化水平和特异位点甲基化状况的方法。 目的:分别建立检测全基因组DNA总体甲基化水平、以及能对CD11a基因启动子区域甲基化状况进行定量、定位的方法。 方法:HPLC方法1.从流动相、检测波长等方面优化高效液相色谱法检测甲基化水平的实验条件;2.检测dC和5-dmC的混合标准品,分别建立两组分的标准方程;3.分别计算日内精密度、日间精密度和回收率,以评价高效液相色谱法的稳定性和重现性;4.水解DNA,使之成为dC、5-dmC等脱氧核苷;检测DNA水解产物,把峰面积代入标准方程,分别计算两组分的浓度,以5-dmC/(dC+5-dmC)比值代表总体甲基化水平;亚硫酸氢钠-PCR-测序法1.确定亚硫酸氢钠转换模板的浓度和作用时间,并对模板进行转换;2.保留CD11a基因启动子序列中CG不变,用T替代其他所有的C,以转换后的序列设计4对引物并分段扩增之;3.设计相应的4对测序引物以测序PCR产物,将测序所获序列与原序列比对,确定发生甲基化的位点,并定量发生甲基化的频率。 结果:HPLC方法1.含0.8%四氢呋喃(v/v)50mM、pH4.1的磷酸氢二铵溶液为HPLC检测DNA总体甲基化水平的最佳流动相,279nm的紫外光是最佳的吸收波长;2.检测混合标准品,分别建立了dC和5-dmC的峰面积-浓度标准方程;3.计算日内精密度和日间精密度,CV<5%,回收率为90-103%;亚硫酸氢钠-PCR-测序法1.确定了转换模板的最佳实验条件是7M的亚硫酸氢钠溶液50℃中孵育DNA凝胶10小时;2.分四段扩增了CD11a基因启动子区域,测序了+20~+250范围,并确定被测序列的甲基化程度是40%,发生甲基化的位点是+45和+131。 结论:本文所建立的高效液相色谱法能够准确灵敏地检测全基因组总体甲基化水平,检测结果稳定,方法重现性好;亚硫酸氢钠-PCR-测序法能够定量、定位CD11a基因启动子区域甲基化状况,相对于其他方法,省时、省标本。


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