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树鼩、小鼠HBx、ras转基因模型及体外HBV感染模型的研究

张晶晶  
【摘要】: 肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是世界上最常见的恶性肿瘤之一。在肝癌病因学方面,目前倾向于多因素、多步骤发生且多个因素间交互作用的观点。乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)感染是肝癌最重要的病因之一,在发展中国家尤为突出。全世界大约有53%,我国约90%的HCC病例与HBV相关。近来的研究表明乙肝病毒表面抗原(HBsAg)携带者发生HCC的机率是非感染者的25~37倍。因此,研究HBV的感染和致癌机理无疑有着重要的意义。但因缺乏体外的增殖系统和易获得的动物模型、细胞模型,HBV感染肝脏的早期机理研究进展较为缓慢,从而在一定程度上影响乙型肝炎及其相关肝病的研究。本研究尝试用睾丸介导基因转移法(TMGT),构建转HBx、ras基因树鼩和小鼠,为从整体水平研究HBV感染诱发肝癌作用的机制提供理想的动物模型。另一方面,选用树鼩作为原代肝细胞的供体,成功构建了HBV感染树鼩肝细胞的体外模型,并在此基础上初步探讨了HBx在HBV感染中的作用及抗病毒药物干扰素-a的作用靶点。 第一部分HBx基因的克隆和序列分析及其真核表达载体的构建 目的通过HBx基因的克隆、序列对比和进化树分析以及pcDNA3.1(+)-HBx真核表达载体的构建,为进一步研究HBx基因与肝癌发生发展的关系打下基础。方法用Oliga6.0结合Primer Premier 5.0软件设计特异性引物,通过PCR方法从广西HBsAg阳性病人血清中(血清型Adrq~+)分离得到的病毒株构建的HBxAg质粒中扩增HBx基因。用DNA star5.01和Vector NTISuite 8.0软件进行序列对比分析和进化树构建。经双酶切将HBx基因定向插入到pcDNA3.1(+)质粒中。结果成功克隆了基因型C型突变型HBx基因,并构建出真核表达载体pcDNA3.1(+)-HBx。新基因被GeneBank接受,在GeneBank上登录号为AY839630。序列对比和进化树分析表明,新克隆的基因与野生基因型C型有高度的同源性(97.8%),2.2%的变异。结论从广西HBsAg阳性病人病毒株(血清型Adrq~+)中发现了新的基因型C型突变型HBx基因(mutant genotype C)。pcDNA3.1(+)-HBx真核表达载体的构建,将为进一步构建转HBx基因树鼩模型并研究HBx基因肝癌发生过程中的作用打下基础。 第二部分K-ras突变基因真核表达载体的构建及在不同来源肝细胞株中的表达 目的构建携带突变K-ras基因,以增强型绿色荧光蛋白(EGFP)为报告基因的重组真核表达载体,导入两种不同的肝细胞株中表达。方法PCR扩增突变K-ras目的基因,将该全长基因定向克隆至真核表达载体pEGFP-N1上,构建重组质粒载体。并利用脂质体转染人肝癌细胞株Huh7.5和鸡肝癌细胞株LMH,在活细胞状态下用荧光显微镜直接观察EGFP在细胞中的表达;用Western blot方法验证K-ras-EGFP融合蛋白的表达。结果酶切和测序证实pEGFP-N1-K-ras重组质粒构建正确,将EGFP报告基因融合在突变的K-ras基因的3'端;在Huh 7.5和LMH中均观察到了绿色荧光,转染率分别为19%和53%;Western blot也检测到融合蛋白的表达。结论通过基因克隆方法成功构建了pEGFP-N1-K-ras重组质粒载体,并且在Huh7.5和LMH中均稳定表达,为下一步构建K-ras转基因树鼩及研究K-ras在肝癌发生中的作用奠定了基础。 第三部分精原干细胞转染法制备转基因小鼠、树鼩的研究 目的探索树鼩人工繁殖和育幼的方法和以精原干细胞转染法制备乙肝病毒X基因(HBx)及突变ras基因的转基因动物的可行性。方法成年雄雌树鼩按1∶1或1∶2配对,根据动物间的适应和受孕情况调整成相对固定的繁殖对。给所有动物建立档案,记录树鼩的生产情况,记录仔动物的每日体重、进食量和健康情况。对仔树鼩用三种方法进行人工喂养,即配方乳喂养、被动和主动母乳喂养。将构建携带HBx基因和突变ras基因的真核表达载体pcDNA3.1-HBx及pEGFP-N1-K-ras用脂质体包被,注入5只雄性小鼠和14只雄性树鼩睾丸组织中。注射后4周,将上述处理过的雄性动物与雌性动物合笼交配。小鼠出生后2~4周后剪其尾尖,仔树鼩出生后1个月取其肝组织作活检,并以多聚酶链式反应(PCR)检测目的基因是否整合入基因组DNA。结果注射的小鼠和树鼩都具有繁殖能力,共产仔小鼠35只,仔树鼩33只。3只仔鼠PCR结果阳性(阳性率8.6%),其中两只仔鼠HBx基因阳性,1只仔鼠HBx、ras基因均为阳性。2只仔树鼩HBx基因阳性(阳性率6.1%)。结论表明以精原细胞作为载体,建立带HBx及ras基因的动物模型是可行的,为进一步研究HBx及K-ras基因在肝癌发生中的作用奠定了基础。 第四部分两种原代树鼩肝细胞的分离和培养方法的研究 目的探讨体外培养原代树购肝细胞的分离方法。方法以成年树鼩和新生树鼩做为肝供体,分别采用体外两步灌流法和Percoll梯度离心方法获取肝细胞并进行体外培养;以台盼蓝染色法测细胞存活率,在相差倒置显微镜下观察细胞形态变化,MTT法测培养细胞活性,并采用PAS染色法鉴定。结果分离收获成年树鼩肝细胞较新生树鼩肝细胞存活率高;培养过程中,新生树鼩肝细胞较成年树鼩肝细胞生长快,增殖能力强,具有统计学意义;PAS染色观察,新生树鼩和成年树鼩肝细胞中充满大量糖原颗粒,两者差异无显著性。结论两种方法均可用于原代树鼩肝细胞的体外培养。 第五部分人乙肝病毒体外感染树鼩肝原代细胞的研究 目的为进一步研究人类乙肝病毒(HBV)提供接近自然感染状态的理想细胞模型。方法体外二步灌流法分离树鼩原代肝细胞,纯化后的乙型肝炎病人血清感染上述肝细胞,用Southern blot和Northern blot检测感染后细胞内的DNA和RNA,用ELISA方法检测细胞上清的HBsAg,用免疫组化检测细胞内HBsAg的表达。结果可检测出肝细胞内cccDNA、ssDNA、pgRNA和sgRNA,感染后第7天,信号开始增强,持续到实验结束的第14天。细胞上清中HBsAg自第1天到第5天S/CO值逐渐下降,随后S/CO值逐渐升高。感染后14天,用免疫组化法可检测到树鼩肝细胞胞浆内的HBsAg抗原表达,阳性率约10%。结论HBV可在原代树鼩肝细胞中稳定复制和表达。 第六部分人乙肝病毒感染树鼩原代肝细胞模型的应用 第一章HBx失活的乙肝病毒可感染树鼩原代肝细胞 目的研究HBx蛋白在HBV复制中的作用。方法用含有HBX21(HBx基因的起始端插入终止密码子而失活)的HBV质粒瞬时转染Huh7.5肝细胞株,用Southern blot检测转染后细胞内的HBV DNA,用Western blot方法检测HBx蛋白的表达。收集转染后第5天的细胞上清并用PEG2000纯化后,接种到体外培养的树鼩原代肝细胞中,收集感染后第8天的树鼩肝细胞,提取细胞总DNA后用Southern blot检测HBV DNA。结果转染HBV(HBX21)质粒的Huh 7.5细胞中未检测到HBx蛋白的表达,可检测到ssDNA,感染后的树鼩原代细胞中可以检测到cccDNA。结论HBV复制中间体的出现证明HBx失活的HBV以转染和感染两种方式进入细胞后都可以在胞内复制,HBx在HBV复制循环中没有起到关键作用。 第二章干扰素-α抑制人类乙肝病毒复制的研究 目的在体外感染HBV的模型中研究IFN-a对HBV复制的影响,探讨其抑制病毒复制的作用靶点。方法不同剂量IFN-a作用于感染HBV的树鼩原代肝细胞5天后,用ELISA试剂盒测定细胞上清中HBsAg的分泌表达水平,用Southern blot检测HBV DNA,用Northern blot方法检测MxA和HBV RNA。结果IFN-a可以诱导MxA的生成,抑制培养细胞上清液中HBsAg的分泌和复制中间体pgRNA和sgRNA的生成,且呈剂量依赖性,但对cccDNA无明显抑制作用。结论IFN-a在体外HBV感染的PTH模型中可抑制病毒复制。


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