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血管内皮细胞在放射性肺损伤中的作用及茶多酚放射防护的实验研究

李坚  
【摘要】: 目的:放射性肺损伤是胸部肿瘤放射治疗后的常见并发症,病程上表现为急性放射性肺炎和迟发性肺纤维化。该损伤一旦发生,至今仍没有有效的治疗办法,严重影响胸部肿瘤放射治疗的局部控制率和患者放疗后的生存质量,但其发病发病机理至今仍未明了。因此,研究放射性肺损伤的发病机理,并寻找有效的防治药物具有重要意义。本研究通过给予大鼠右肺不同的单次照射剂量,建立起大鼠放射性肺损伤模型,利用CT影像学手段,结合病理形态学检测,免疫组织化学、Western blotting等检测技术,观察、分析大鼠放射性肺损伤的发生、发展过程及其可能的发病机制,尤其是重点探讨血管内皮细胞在放射性肺损伤中的作用;本研究还通过照射人脐静脉内皮细胞的方法,建立体外放射损伤模型,观察放射对体外培养的内皮细胞的损伤效应;并以体外实验为基础,设计茶多酚体外防护血管内皮细胞放射损伤的在体实验研究,综合观察、分析茶多酚对放射性肺损伤的干预作用及其可能机制。 方法:本研究分三个部分:第一部分,建立大鼠放射性肺损伤模型及相关研究;第二部分,血管内皮细胞照射后细胞凋亡的体外研究;第三部分,茶多酚对放射性肺损伤的干预实验。第一部分的实验方法包括:采用60Co治疗机产生的γ线单次照射大鼠的右肺,照射剂量分别为0 Gy、7.0 Gy、14.4Gy,观察时点为照射后1天(以下以d表示)、7天(1周)、30天(1月)和90天(3月),取对照组及各照射组大鼠的肺组织进行相关检测,包括:①大鼠放射性肺损伤的病理学观察,包括大体病变、H-E染色光学显微镜;②肺纤维化改变的检测包括:分光光度与酸解法测定肺组织羟脯氨酸浓度;免疫组织化学法检测肺组织TGF-β1的表达;③TUNEL法检测肺组织的细胞凋亡;④Western blotting检测肺组织血管内皮细胞相关标志CD34、CD105和VEGF的表达水平;⑤免疫组织化学法检测肺组织炎性因子TNF-α。第二部分,血管内皮细胞照射后细胞凋亡的体外研究,用60Coγ线单次照射体外培养的人脐静脉内皮细胞,剂量分别为0 Gy、7.0 Gy、14.4Gy和30.0Gy,细胞凋亡检测指标包括:①血管内皮细胞DNA损伤的“彗星”实验;②血管内皮细胞凋亡率采用Annexin V / PI染色法后流式细胞术检测;③血管内皮细胞Caspase-3的活性与细胞线粒体膜电位变化采用流式细胞术检测。第三部分,茶多酚放射性肺损伤的干预实验,采用60Coγ线14.4Gy单次照射建立大鼠肺放射损伤模型和体外人脐静脉内皮细胞凋亡模型,分别采用500mg/kg剂量的茶多酚进行体内干预和10μg/L、100μg/L、1000μg/L三个数量级的茶多酚进行体外干预,分别检测:①体外细胞凋亡检测指标:采用Annexin V / PI染色法检测血管内皮细胞的凋亡,流式细胞术检测血管内皮细胞Caspase-3的活性和线粒体膜电位变化,以观察血管内皮细胞的凋亡改变情况;②体内试验指标:茶多酚干预后对放射性肺损伤大鼠血清SOD与MDA的检测采用比色法,采用Western blotting法检测茶多酚干预后肺损伤组织血管中CD34、CD105、VEGF表达的变化,免疫组织化学法检测茶多酚干预后肺损伤组织中TNF-α表达的变化。 结果:第一部分,建立大鼠放射性肺损伤模型及相关研究的结果为:①受照射后肺大体标本变化:在各观察时点,7.0Gy组大鼠肺均未见明显的片状出血与明显的水肿;在照射后一个月开始,14.4Gy组大鼠肺可见片状出血和明显的水肿和肿胀;②肺组织病理改变:光镜下病理学改变:照射后1d、7d,7.0Gy组大鼠肺泡腔及间隔可见轻微渗出、充血和水肿;14.4Gy组大鼠肺泡腔及间隔可见渗出、充血、水肿和炎性细胞浸润,局部见红细胞渗出;照射后30 d,7.0Gy组大鼠肺泡腔及间隔出现轻微水肿和炎性细胞浸润;14.4Gy组见肺泡间隔增宽、水肿、炎性细胞浸润和出血,并可见胶原形成;照射后90 d,14.4Gy组肺泡间隔进一步增宽,局部仍见出血,部分肺泡腔塌陷、不张,并且出现明显的胶原形成与纤维化改变。③肺纤维化相关指标的变化情况:TGF-β1:7.0 Gy组在照射后1月与3月可见弱阳性表达;14.4 Gy组大鼠肺组织的TGF-β1在整个观察期均呈阳性表达;羟脯胺酸含量:照射后1d与7 d,对照组、7.0Gy、14.4 Gy组羟脯胺酸含量无明显差别;但在照射后一个月开始,14.4 Gy组大鼠肺部羟脯胺酸含量均明显高于正常对照组;④肺组织细胞因子TNF-α表达:7.0 Gy组在放射后1d表达阳性,但在其他每个观察时点,基本处于低水平表达或阴性;14.4Gy组的TNF-α在各时点均为阳性表达;⑤肺血管内皮细胞相关标志CD34、CD105与VEGF表达水平的变化:14.4 Gy组大鼠肺部用定量的蛋白印迹法检测CD34、CD105,发现照射后1d、7d,CD34、CD105蛋白表达水平降低;与第1d比较,到照射后第30d、第90d,CD34无显著变化,而CD105则可有升高趋势,但仍低于正常组水平。此外,还发现14.4 Gy组照射后第1d、第7d, VEGF水平有升高趋势,但在第30d、第90d,VEGF水平较前降低,并明显低于对照组水平。第二部分,血管内皮细胞照射后细胞凋亡的体外研究,结果主要为:①彗星试验:随着照射剂量的增加,“彗星”尾长、细胞百分率升高均呈增加趋势,各照射组的“彗星”细胞率以及“彗星”尾长均明显高于对照组;②照射后血管内皮细胞的凋亡情况:7.0 Gy组,内皮细胞的早期凋亡阳性率与晚期凋亡阳性率分别为16.5%±6.6%、10.8%±5.1%,;14.4 Gy组、30.0 Gy组的早期凋亡阳性率与晚期细胞凋亡阳性率也显著升高,分别为36.8%±8.2%、16.8%±6.1%;以及43.1%±6.2%、18.2%±5.8%;③Caspase-3阳性率与线粒体损伤率分别为:对照组:1.6%±0.9%、2.2%±0.8%;7.0 Gy组:9.9%±2.2%、8.4%±1.8%;14.4 Gy组:26.8%±4.6%、36.2%±4.1%;30.0 Gy组:35.2%±3.6%、38.3%±3.1%。第三部分,茶多酚对放射性肺损伤的干预实验,结果为:①体外试验发现10μg/L干预组无显著改变;100μg/L干预组与1000μg/L干预组的早期凋亡率分别为23.1%±5.8%、20.2%±4.6%,显著低于14.4 Gy放射损伤组,其中1000μg/L干预组晚期凋亡阳性率为8.9%±2.6%,也显著低于14.4 Gy放射损伤组;100μg/L干预组的线粒体损伤率为24.3%±4.8 %,显著低于14.4 Gy放射损伤组;1000μg/L干预组Caspase-3阳性率与线粒体损伤率分别为16.2%±3.9%、18.3%±5.8%,两组检测指标均显著低于14.4 Gy放射损伤组。进一步的体内试验发现:①与正常对照组比较,14.4 Gy组大鼠SOD水平在照射后1d明显升高,7d则变化不大,30d、90d时则明显降低;在茶多酚干预后,除第7天外,大鼠SOD的水平均高于正常对照组,其中30d和90d明显高于14.4 Gy照射组大鼠SOD的水平;茶多酚干预组,MDA水平除第7天外,均显著高于正常对照组;但与14.4 Gy组比较,MDA水平明显降低;②14.4 Gy组与茶多酚干预组大鼠肺部做定量的蛋白印迹测定CD34、CD105、VEGF表达水平,发现茶多酚干预组与放射损伤14.4 Gy组之间的表达水平无显著差别;③尽管经茶多酚干预,但照射后肺部出现呈TNF-α阳性表达的吞噬细胞以及炎性细胞均无明显降低的趋势,依然为阳性表达。 结论:1、放射性肺损伤呈明显的剂量和时间依赖性;肺血管内皮细胞放射损伤及损伤后的修复不良,可能是后续炎症反应、纤维化等一系列损伤的关键因素。 2、体外培养的血管内皮细胞受到电离辐射后可通过线粒体途径以及Caspase家族介导的凋亡信号转导途径诱发细胞凋亡。 3、茶多酚可通过提高机体的抗氧化损伤能力而减轻放射所导致的损伤,对放射性肺损伤有一定的防护作用。


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