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血管紧张素Ⅱ体外诱导神经干细胞分化为多巴胺能神经元的机制研究

罗小丹  
【摘要】: 目的:体外分离、培养神经干细胞(neural stem cells,NSCs),在此基础上探讨血管紧张素Ⅱ(AngiotensinⅡ,AⅡ)诱导NSCs定向分化为多巴胺(Dopamine,DA)能神经元的过程中血管紧张素1型(AT1)受体和血管紧张素2型(AT2)受体所起的作用。 方法:在无血清培养基中分离培养NSCs,通过神经球法扩增培养NSCs,巢蛋白(Nestin)免疫细胞化学法对NSCs进行鉴定,绘制生长曲线观察NSCs的自我更新和增殖能力;在此基础上,将第二代的NSCs在含10%胎牛血清(FBS)的培养基中按照实验设计分为6组,分别是,A:对照组,B:AII组,C:AT1受体拮抗剂ZD7155组,D:AT1受体拮抗剂ZD7155+AⅡ组,E:AT2受体拮抗剂PD123319组,F:AT2受体拮抗剂PD123319+AⅡ组,观察NSCs的多向分化潜能,免疫细胞化学法检测分化为神经元、胶质细胞的能力,即神经元特异性烯醇化酶(neuron special enolase,NSE)、胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)以及以及2,3-环核苷酸磷酸二脂酶(cyclic nucleotide phosphohydrolase,CNP)的表达,计算NSE+、GFAP+细胞分化率。通过酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)免疫细胞化学进行DA能神经元鉴定,并观察各组向DA能神经元定向诱导分化的能力以及DA能神经元突触的长度变化,通过实时荧光定量PCR检测各实验组中TH基因表达水平。 结果:体外分离培养的NSCs,在培养基中呈悬浮生长,神经球表达Nestin。诱导分化的细胞呈NSE、GFAP、CNP免疫阳性着色,表明分离培养的细胞具有自我更新和多向分化潜能。AII组NSE+细胞分化率为10.23%,明显比对照组增高,差异有统计学意义(P0.05)。检测GFAP+细胞分化率中,B组(AII)、D组(ZD7155+AII)、F组(PD123319+AII) GFAP+细胞分化率分别为49.65%、48.70%、50.97%,均明显高于对照组的44.7%,差异有统计学意义(p0.05)。对于DA能神经元的检测,实时荧光定量PCR法检测结果,B组(AII)、D组(ZD7155+AII)的TH基因表达水平高于对照组,差异有统计学意义(p0.05),C组(ZD7155)、E组(PD123319)、F组(PD123319+AII)的TH基因表达水平与对照组比较无差异(p0.05)。免疫细胞化学法检测TH的表达与上面一致。各组DA能神经元的突触长度没有明显差别(p0.05) 结论:外源性AII能诱导NSCs分化为神经元、星形胶质细胞比例增多。AII诱导产生DA能神经元的作用是由AT2受体介导,激活AT1、AT2受体均不能诱导DA能神经元突触延长或抑制突触延长。


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