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线粒体Cx43预防兔心肌缺血/再灌注损伤作用机制的研究

何燕  
【摘要】: 缺血心肌再灌注过程中常易发生缺血再灌注损伤(ischemia reperfusion injury, IRI),心肌IRI是临床上常见的一种心肌损害现象,并且其机制复杂。目前心肌IRI保护的干预措施主要包括缺血预处理(ischemic preconditioning,IP)、药物预处理和缺血后处理(ischemic postconditioning,PC),PC、IP和药物预处理等存在一些共同的保护机制。研究发现PC具有明显的心肌保护作用,但是其确切机理至今仍未完全阐明。近年来在体、离体的研究证实IRI早期引起Cx43脱磷酸化,缝隙连接(Gap junction,GJ)开放,引起坏死物质的传播导致梗死加重。GJ参与IRI,以GJ为靶点的抗IRI药物可能是一个新的发展方向,Heptanol(庚醇)作为GJ的解耦联剂,在临床上有潜在运用价值。2005年Schulz等首次在心肌线粒体上发现缝隙连接蛋白43(connexin 43,Cx43)的表达,线粒体Cx43在IP中作用也成热点研究之一。新近研究提示心肌线粒体以及线粒体Cx43在心肌IRI损伤以及IP心肌保护中具有非常重要的作用。同时在IP心肌保护作用中线粒体ATP敏感钾通道(mitoKATP)参与GJ调控。 而Cx43在PC与Heptanol预处理中少有研究,尤其是线粒体中Cx43在PC和Heptanol预处理中作用至今未见报道。故我们设想线粒体Cx43在PC和Heptanol预处理保护缺血再灌注心脏中也同样起重要作用, PC与Heptanol保护的机制可能也是通过激活mitoKATP,使细胞膜和线粒体Cx43的数量、分布及功能发生变化,减少损伤因子在细胞间的扩散,同时增强细胞线粒体自身的稳定及抗损伤能力,从而达到抗IRI损伤的效益。本实验旨在探讨线粒体及线粒体Cx43是否参与PC和Heptanol的心肌保护作用及其可能机制。 本研究建立兔心肌IRI模型,给予PC和Heptanol预处理,并应用5-羟葵酸(5-HD)即线粒体ATP敏感性钾通道(mitoKATP)特异性阻滞剂,观察PC和Heptanol对IRI兔心肌保护作用及线粒体Cx43在其中所起的作用。本课题共分为四个部分加以研究,即(1)PC及Heptanol预处理对兔IRI的影响;(2)PC及Heptanol预处理对兔IRI心肌细胞凋亡与线粒体结构及功能的影响;(3)PC及Heptanol预处理对兔IRI的细胞膜及线粒体Cx43影响;(4)mitoKATP和线粒体Cx43在缺血后处理和Heptanol预处理相关IRI中的作用。 第一部分缺血后处理及Heptanol预处理对兔心肌缺血/再灌注保护作用 目的:建立兔IRI模型,观察PC、Heptanol预处理对兔IRI的保护作用。 方法:80只新西兰大白兔随机分为5组,雌雄不分,分别为假手术组(Sham)、心肌缺血/再灌注模型组(IR)、缺血预处理组(IP),缺血后处理组(PC)以及Heptanol预处理组(HT),每组16只。假手术组左冠状动脉前降支近端穿线但不结扎,观察4h,其余4组则结扎30min后,松开结扎线,予4h再灌注。分别于结扎前、结扎后30min、再灌注30min、再灌注2h、再灌注4h取颈动脉血测定血浆磷酸肌酸激酶同工酶(CK-MB),肌钙蛋白(cTnI)以及超氧化物歧化酶(SOD)与丙二醛(MDA)含量以及通过颈动脉插管测定上述5个时点的血流动力学指标。再灌注结束后,Even’s和TTC染色法测心梗面积,HE染色观察各组心肌组织结构变化,电镜观察各组心肌细胞超微结构的变化。取心肌组织,制备匀浆液,测定SOD与MDA含量。 结果:1.心肌酶学:与Sham组比较,其余各组CK-MB、cTnI值在结扎30min、再灌30min、再灌2h及再灌4h后明显升高(P 0.01)。与IR组比较,IP组、PC组和HT组的CK-MB、cTnI值在再灌30min、再灌2h和再灌4h后均明显下降(P 0.01)。2.血流动力学指标:各组术前均无差异。术后,与Sham组比较,各处理组结扎后30min、再灌注30min、再灌注2h、再灌注4h的HR、MAP、±dp/dtmax均明显降低,LVEDP明显升高,均有显著性差异(P 0.01);与IR组比较,IP、PC和HT组的MAP、±dp/dtmax(P 0.05)和LVEDP(P 0.01)各指标在再灌注2h、4h明显改善,有统计学意义。3.心梗面积: IP,PC和HT组的心梗面积明显小于IR组,差异有统计学意义(P 0.01)。3.心肌组织结构的变化和心肌超微结构的变化:光镜与电镜显示结果,与Sham组比较,IR组心肌细胞损伤明显;与IR组比较,IP、PC和HT组心肌细胞损伤减轻明显。4.心肌组织匀浆及血清中SOD与MDA变化:缺血再灌注4h后,与Sham组比较,IR组SOD活性明显降低, MDA明显升高,差异有统计学意义(P 0.01)。与IR组比较,IP和PC组SOD活性明显升高,MDA明显减低,差异有统计学意义(P 0.01);而HT组SOD与MDA活性改变无显著性差异(P 0.05)。 结论:PC与Heptanol预处理对兔心肌IRI的具有保护作用。 第二部分缺血后处理、Heptanol预处理对兔心肌缺血/再灌注心肌细胞凋亡及线粒体结构、功能的影响 目的:建立兔缺血再灌注模型,观察PC、Heptanol预处理对兔心肌IRI心肌凋亡、线粒体结构即功能的影响。 方法:80只新西兰大白兔随机分为5组,动物模型制备、分组及纳入例数均与第一部分相同。采用TUNEL法检测各组缺血心肌细胞凋亡,用透射电镜观察心肌线粒体的超微结构改变,同时检测线粒体膜电位、Ca2+浓度、丙二醛(MDA)浓度、超氧化物岐化酶(SOD)活性的改变。 结果:与IR组比较,PC、HT和IP组兔心肌细胞凋亡减少(P 0.01),心肌线粒体形态结构改变明显减轻(P 0.01);线粒体跨膜电位明显升高(P 0.01)、线粒体Ca2+浓度(P 0.05)明显下降,差异有统计学意义;PC、HT和IP组比较差异无统计学意义(P 0.05)。与IR组比较,HT组SOD与MDA改变差异无统计学意义(P 0.05);IP组和PC组SOD活性明显升高、MDA浓度均下降,差异有统计学意义(P 0.05)。 结论:PC、Heptanol可能通过提高线粒体跨膜电位、减轻线粒体钙超载以致改善缺血再灌注心肌细胞损伤、减轻心肌凋亡;PC可降低线粒体氧自由基水平,而与PC心肌保护机制不同的是,HT不能降低线粒体氧自由基水平。 第三部分缺血后处理、Heptanol预处理对兔心肌缺血/再灌注损伤中细胞膜及线粒体Cx43的影响 目的:探讨PC、Heptanol对兔IRI中细胞膜及线粒体Cx43的影响。 方法:兔80只,建立心肌IRI模型,随机分5组,每组16只:假手术组(Sham组)、缺血再灌注组(IR组)、缺血预处理组(IP组)、缺血后处理组(PC组)和Heptanol预处理(HT组)。应用电镜观察各组闰盘结构变化;应用免疫组化、免疫荧光法检测细胞膜Cx43-GJ分布及含量变化;采用差速离心法提取各组缺血区心肌线粒体蛋白,应用Western blot检测线粒体Cx43蛋白含量。进一步从转录水平采用RT-PCR检测Cx43mRNA表达。 结果:(1)闰盘结构变化与Sham组比较,IR组闰盘及GJ结构不清,可见移位、断裂。与IR组比较,IP、PC和HT组的闰盘病变明显减轻。(2)细胞膜Cx43、GJ与Sham组比较,IR组GJ重构明显,胞膜Cx43含量明显减少(P 0.01)。与IR组比较,IP、PC和HT组的GJ重构明显减轻,并且胞膜Cx43含量增加(P 0.01)。(3)线粒体Cx43蛋白与Sham组比较,IR组线粒体Cx43蛋白显著下降(P 0.01);与IR组比较,PC组、HT组和IP组心肌线粒体Cx43明显升高(P 0.01)。 结论:PC、Heptanol预处理可以减轻IRI引起的闰盘损伤、细胞膜和线粒体Cx43的减少及改善GJ重构,细胞膜与线粒体Cx43可能参与了PC和Heptanol预处理的心肌保护作用。 第四部分线粒体ATP敏感钾通道和线粒体Cx43在缺血后处理和Heptanol预处理相关缺血/再灌注损伤中的作用 目的:探讨线粒体ATP敏感钾通道和线粒体Cx43在PC和Heptanol保护兔IRI中的作用。 方法:兔112只,建立IRI模型,随机分7组,每组16只:假手术组(Sham组)、缺血再灌注组(IR组)、缺血后处理组(PC组)和Heptanol预处理(HT组)、缺血后处理组+5HD组(PC+5HD组)和Heptanol预处理+5HD组(HT+5HD组)。假手术组左冠状动脉前降支近端穿线但不结扎,观察4h,其余4组则结扎30min后,予4h再灌注。取血测定结扎前、结扎后30min、再灌注30min、再灌注2h、再灌注4h血浆CK-MB、cTnI以及SOD与MDA含量。实验结束后,Even’s和TTC染色法测心梗面积。电镜观察心肌细胞超微结构尤其是线粒体与闰盘结构的变化。TUNEL法检测缺血心肌细胞凋亡。免疫荧光检测胞膜cx43-GJ变化以及胞膜Cx43含量,差速离心法提取线粒体,并检测线粒体膜电位、Ca2+浓度、MDA浓度、SOD活性的改变。应用Western Blot检测线粒体Cx43蛋白含量。进一步用RT-PCR检测心肌组织中Cx43mRNA改变。 结果:再灌注4h末,IP、PC和HT组的血浆CK-MB、cTnI及心梗面积明显低于IR、PC+5HD和HT+5HD组(P 0.01)。与IR、PC+5HD和HT+5HD组比较,IP、PC和HT组兔心肌细胞凋亡减少,心肌、闰盘及线粒体形态结构改变明显减轻,线粒体跨膜电位、SOD活性明显升高,线粒体Ca2+浓度、MDA浓度均下降。免疫荧光检测细胞膜Cx43、GJ及Western Blot检测线粒体Cx43蛋白发现,与Sham组比较,IR、PC+5HD和HT+5HD组细胞膜与线粒体Cx43蛋白显著下降(P 0.01);与IR组比较,PC、HT、IP、PC+5HD和HT+5HD组心肌胞膜和线粒体Cx43明显升高(P 0.01和P 0.05))。与PC+5HD和HT+5HD组比较,IP、PC和HT组胞膜Cx43及线粒体Cx43蛋白明显升高(P 0.01)。 结论:PC、Heptanol预处理可以减轻IRI引起的闰盘损伤、改善GJ重构、减轻IRI所致的细胞膜及线粒体Cx43的含量,其可能通过提高线粒体跨膜电位、减轻线粒体钙超载、改善缺血再灌注心肌细胞凋亡等来达到对兔IRI的保护作用。细胞膜、线粒体Cx43可能参与了PC和Heptanol预处理的心肌保护作用,其机制与mitoKATP有关。PC也可降低线粒体氧自由基水平。


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