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苦参素通过自噬调节结肠癌化疗耐药的实验研究

苏建伟  
【摘要】:目的:探讨苦参素对结肠癌耐药细胞自噬水平的影响,从而对苦参素逆转化疗耐药机制进行初步探讨,为临床上结肠癌的治疗方案提供理论依据。方法:(1)采用细胞活力检测试剂盒CCK-8,通过不同苦参素浓度干预人结肠癌细胞(HCT-8)及人结肠癌耐长春新碱细胞株(HCT-8/VCR)细胞,药物作用24h后检测两株细胞活力,探讨苦参素对人结肠癌细胞(HCT-8)及人结肠癌耐长春新碱细胞株(HCT-8/VCR)细胞活力的影响;(2)采用细胞自噬染色检测试剂盒单丹磺酰尸胺(Dansylcadaverine,MDC),检测苦参素作用两株细胞24h后,细胞内自噬体的产生情况;Western Blotting法检测自噬相关基因P62、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1蛋白的表达水平,探讨苦参素对HCT-8及HCT-8/VCR细胞自噬的影响。(3)采用自噬抑制剂氯喹、自噬激活剂雷帕霉素预先干预HCT-8/VCR细胞1h后,加入苦参素继续作用24h后检测细胞内自噬体情况;以及自噬相关蛋白P62、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1蛋白的表达水平,进一步研究苦参素对HCT-8/VCR细胞自噬的影响。(4)数据分析采用SPSS20.0统计软件,计量资料数据采用均值±标准差(mean±SD)表示,实验结果由三次单独实验获得。多组计量资料比较采用方差分析,组间比较采用SNK-q法,组内比较采用配对资料的t检验,统计学检验水准取双侧?=0.05。结果:(1)苦参素对HCT-8细胞活力的影响结果:与空白组相比较,苦参素1.00mg/ml~10.0mg/ml使HCT-8细胞活力显著下降,且呈剂量依赖性,即苦参素剂量越大,HCT-8细胞活力下降越大。苦参素对HCT-8/VCR细胞活力的影响结果:与空白组相比较,苦参素1.00mg/ml~10.0mg/ml使HCT-8/VCR细胞活力显著下降,且呈剂量依赖性,即苦参素剂量越大,HCT-8/VCR细胞活力下降越大。苦参素对HCT-8及HCT-8/VCR细胞活力的影响比较:相同剂量苦参素作用下,HCT-8/VCR细胞活力下降程度大于HCT-8,但未发现二者具有统计学差异。(2)苦参素对HCT-8及HCT-8/VCR细胞自噬体形成的影响:加入苦参素后,HCT-8/VCR细胞中自噬体产生减少,且呈剂量依赖性,即苦参素剂量越大,HCT-8/VCR细胞中自噬体越少;HCT-8细胞无明显变化。苦参素对HCT-8及HCT-8/VCR细胞自噬相关蛋白的影响:苦参素对HCT-8细胞自噬相关蛋白无明显改变,但是可以提高HCT-8/VCR细胞P62表达,降低LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1表达,抑制自噬,且呈剂量依赖性,即苦参素剂量越大,HCT-8/VCR细胞中P62表达越高,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1表达越低。苦参素对自噬抑制剂或激活剂调节HCT-8/VCR细胞自噬体形成的影响:苦参素可以增强自噬抑制剂作用,抑制自噬,表现为HCT-8/VCR细胞中自噬体产生进一步减少,而苦参素可以逆转自噬激活剂诱导自噬的作用,表现为HCT-8/VCR细胞中自噬体产生先增多后减少。苦参素对自噬抑制剂或激活剂调节HCT-8/VCR细胞自噬相关蛋白的影响:苦参素可以增强自噬抑制剂作用,抑制自噬,表现为P62表达进一步增加,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1表达进一步减少,而苦参素可以逆转自噬激活剂诱导自噬的作用,表现为P62减少的恢复,而LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1增加的恢复。结论:(1)1.00mg/ml~10.0mg/ml的苦参素能显著降低HCT-8、HCT-8/VCR细胞活力,且呈剂量依赖性,而且相同剂量苦参素作用下,HCT-8/VCR细胞活力下降程度大于HCT-8,但未发现二者具有统计学差异。(2)苦参素可使HCT-8/VCR细胞中自噬体减少,抑制结肠癌耐长春新碱细胞株HCT-8/VCR的自噬作用,逆转化疗耐药,其机制可能是通过提高HCT-8/VCR细胞P62表达,降低LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1表达,抑制自噬。


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