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氯化两面针碱对人口腔鳞癌耐药逆转及与PI3K/Akt/mTOR信号通路的相关研究

范玉琴  
【摘要】:目的:本课题选用课题组前期筛选出的人口腔鳞癌耐药细胞株KB/ADM及其亲本细胞KB进行实验,研究氯化两面针碱(NC)对KB/ADM细胞的耐药逆转作用及NC对PI3K/Akt/mTOR信号通路中相关基因及关键蛋白表达的影响,探讨NC逆转作用是否与PI3K/Akt/mTOR信号通路有关。方法:(1)人口腔鳞癌多药耐药细胞的培养和鉴定:(1)MTT法测定KB/ADM及KB细胞对化疗药物的敏感性,配制阿霉素(ADM)、依托泊苷(VP-16)和长春新碱(VCR)各六个浓度组分别为200、100、50、25、10、5mg/L,计算细胞的IC50和耐药倍数。(2)Real-time PCR检测MDR1基因的表达;(3)流式细胞仪检测P-gp蛋白的表达。(2)NC逆转人口腔鳞癌多药耐药细胞耐药性的研究:(1)MTT法测定NC对KB/ADM的耐药逆转作用,实验分为KB空白对照组、KB+VP-16组、KB/ADM空白对照组、KB/ADM+VP-16组、KB/ADM+VP-16+VRP组、KB/ADM+VP-16+NC组,加药组每组设5个不同浓度(200、100、50、25、10mg/L),计算细胞的IC50和耐药倍数。(2)体外划痕实验,分组方法同“(2)(1)”,计算细胞迁移率;(3)Transwell侵袭实验,分组及加药方式方法同“(2)(2)”,倒置显微镜下观察穿过Transwell小室膜底的已染色的细胞,随机拍照并计数;(4)流式细胞仪检测NC对KB/ADM及KB细胞的凋亡率;(5)Real-time PCR检测Bax、Bcl-2和Survivin因子的表达。(3)NC对PI3K/AKT/mTOR通路相关基因及蛋白表达的影响:(1)Real time PCR检测NC对P53、PTEN基因表达的影响;(2)Western blot检测NC对AKT[Y89]、AKT(S473)、mTOR、4EBP1[Y329]、4EBP1(T37)、S6K1[E175]和S6K1(S235+S236)蛋白表达的影响。结果:(1)(1)根据实验结果显示,KB/ADM细胞对ADM、VP-16、VRP三种化疗药的IC50/mg·L-1分别为(158.2±1.21)、(73.21±4.83)及(84.48±2.48),KB细胞对ADM、VP-16、VRP三种化疗药的IC50/mg·L-1分别为(44.72±3.08)、(38.78±3.56)及(36.53±0.73),KB/ADM细胞对ADM、VP-16和VRP的耐药倍数分别为3.54、1.89和2.42;(2)KB/ADM及KB细胞MDR1基因的相对表达为(1.01±0.03)、(0.22±0.01);(3)KB/ADM及KB细胞P-gp蛋白的相对表达为(95.58±3.03)、(0.23±0.05)。(2)(1)耐药性检测实验结果为:KB/ADM+VP-16组、KB/ADM+VP-16+VRP组和KB/ADM+VP-16+NC组的IC50/mg·L-1分别为(121.14±8.31)、(34.75±1.36)、(7.37±1.30),KB/ADM+VP-16+VRP组和KB/ADM+VP-16+NC组的逆转倍数分别为3.49、16.44;(2)划痕48h后,敏感组的迁移率分别为(30.51±0.88)%、(40.89±0.05)%和(23.17±1.49)%,差异有统计学意义(P0.01);耐药组的迁移率分别为(29.83±1.78)%、(28.05±1.05)%、(17.45±1.82)%和(14.12±0.26)%,具有显著差异(P0.01);(3)KB 25mg/L VP-16组(27.70±0.76)及KB100mg/L VP-16组(17.50±0.50)的侵袭能力分别与KB空白组(85.80±1.68)比较,差异具有统计学意义(P0.01);KB/ADM25mg/L VP-16组(59.20±2.60)、KB/ADM25mg/L VP-16+VRP组(47.10±4.24)及KB/ADM25mg/L VP-16+NC组(29.9±3.10)依次与KB/ADM空白组(100.00±1.50)比较,差异具有统计学意义(P0.01);(4)依次加药处理48h后经流式细胞仪检测,各组凋亡率分别为(0.87±0.41)%、(7.00±1.40)%、(24.37±4.92)%、(0.33±0.21)%、(7.97±2.90)%、(9.57±4.97)%和(48.37±7.45)%;(5)Bax基因在耐药组中相对表达量均具有显著性差异(P0.01)并呈上调趋势,敏感组中该基因的表达水平也有显著上调;Bcl-2基因在耐药组中表达呈显著的下调趋势,而敏感组中表达差异无统计学意义,耐药细胞加VRP组和NC组中Survivin基因相对表呈下调趋势,且差异具有统计学意义(P0.01)。(3)(1)PTEN基因相对表达量结果,敏感组中该基因表达水平上调,差异无统计学意义,在耐药组细胞中依次呈上调趋势(P0.01);P53相对表达结果,敏感组中该基因相对表达均无统计学意义,在耐药组中表达均上调(P0.01,P0.05,P0.01);(2)非磷酸化AKT,在敏感组中表达都有所增加且差异无统计学意义,耐药各组除KB/ADM25mg/L VP-16+NC组外均增加,差异具有统计学意义(P0.01),磷酸化的AKT在耐药组中表达依次减少且差异无统计学意义,敏感组中低剂量组有显著差异(P0.05);mTOR在KB/ADM25mg/LVP-16+NC组中差异显著(P0.01);非磷酸化4EBP1在各组中的表达均无统计学意义,磷酸化4EBP1在加VRP和NC组中差异显著(P0.01,P0.01);非磷酸化S6K1在敏感细胞组中的表达依次减少(P0.01,P0.01),磷酸化S6K1在敏感细胞高剂量组中的表达具有统计学意义(P0.01),耐药细胞组中表达依次减少(P0.01,P0.01,P0.01)。结论:(1)KB/ADM细胞经鉴定为MDR细胞株,可用做MDR肿瘤细胞模型进行实验研究。(2)NC具有逆转KB/ADM细胞MDR的作用,Bax、Bcl-2、Survivin三个调控细胞凋亡基因可能与NC诱导KB/ADM细胞的凋亡有关。(3)NC逆转KB/ADM MDR的作用机制可能不是通过对PI3K/Akt/mTOR信号通路的抑制来实现的。


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