麦门冬汤对经典Wnt信号通路诱导骨髓间充质干细胞向肺泡上皮细胞分化的影响

【摘要】：目的:通过在大鼠体内建立肺纤维化(pulmonary fibrosis,PF)模型并提取不同药物血清,体外采取不同处理方式诱导原代骨髓间充质干细胞向Ⅱ型肺泡上皮细胞(typeⅡalveolar epithelial cells,AEC2s)分化,探讨Wnt/β-catenin信号通路在分化过程中的作用。方法:动物实验部分:SD大鼠分为正常组、模型组、麦门冬汤高浓度组、麦门冬汤中浓度组、麦门冬汤低浓度组,每组15只。除正常组外,将SD大鼠麻醉后暴露气管,注入博来霉素(Bleomycin,BLM)(5mg/Kg)建立肺纤维化模型。分别于1、7、14、28天随机取2只正常大鼠和模型大鼠做HE染色。第29天起正常组常规饲养,模型组大鼠给予生理盐水(1ml/100g体积)灌胃,其余3组分别予麦门冬汤高、中、低浓度(1ml/100g体积)灌胃,连续灌胃2周后经腹主动脉取含药血清。细胞实验部分:从2周龄乳鼠中取出胫、股骨,采用不含钙镁离子的PBS浸泡,剪短两端骨骺,利用含2%双抗的完全培养基冲洗骨髓腔至发白,将冲洗出的细胞进行培养。将细胞分为正常组(简称:正常α组)、SAE组、SAE+模型血清组(简称:SMX组)、SAE+麦门冬汤高浓度血清组(简称:SGM组)、SAE+麦门冬汤中浓度血清组(简称:SZM组)、SAE+麦门冬汤低浓度血清组(简称:SDM组)。取生长状态稳定的细胞进行种板,24h后加入无血清SAE培养基进行培养,24h再加入相应血清培养至第5天、第10天后进行Western blot实验,检测SP-C、β-catenin、Wnt3a、WISP1蛋白表达水平。结果:1、根据HE染色结果显示,与正常组比较,造模后第1天可见有部分肺泡壁增厚改变及少许中性粒细胞及嗜酸性粒细胞增生;造模后第7天炎症细胞明显增多,增厚的肺泡壁面积明显增大;造模后第14天肺组织成片出现的明显实质性改变,大部分面积的肺泡壁增厚更显著并可见大量的炎症细胞及轻微的肺纤维化;造模后第28天肺泡明显增大,实质性改变范围较14天更大,基本全是增厚的肺泡壁,炎症细胞较14天稍减轻,但纤维化表现更明显。2、BMSCs生长形态:第2-4代原代骨髓间充质干细胞均为明显的长梭形,且成鱼鳞状或放射状或旋涡状排列,有部分呈圆形或多边形,细胞浆丰富,细胞核大且清晰,核仁明显,可见大部分细胞有2-3个以上数量的核仁。但第3、4代细胞的长梭形细胞占90%左右,细胞体积变大,可见少数圆形细胞或多边形细胞,排列更紧密。3、MTT结果显示:第5天细胞存活率与正常组(10%FBS MEMα完全培养基培养)比较,当含药血清浓度为5%时,除正常α组、SMX组外均有统计学差异(P0.05);当含药血清浓度为10%时,除SDM外均有显著差异(P0.05);当含药血清浓度为15%时,除正常α组外均差异显著(P0.05);SAE组与正常组相比的差异明显(P0.05)。各组各浓度与SAE组比较,均有明显差异(P0.05)。干预到第10天与正常组比较,当含药血清浓度为5%时,各组存活率均存在显著性差异(P0.05);当含药血清浓度为10%时,正常α组、SZM组的差异明显(P0.05),SMX、SGM、SDM组与之比较无统计学意义;当含药血清浓度为15%时,除SGM、SDM组外均差异显著(P0.05);SAE组与正常组相比的差异明显(P0.05)。各组各浓度与SAE组比较,同样存在明显差异(P0.05)。4、显微镜下观察含药血清干预后SAE组多呈短梭形,正常α组、SAE模型组、SGM组、SZM组、SDM组多呈长梭形;SAE组旋涡状排列结构稀少,且细胞散在分布,其余组明显表现为鱼鳞状或旋涡状排列,结构紧密。5、Western blot结果分析显示:SP-C蛋白表达情况:干预至第5天SMX组、SGM组的SP-C蛋白含量较高于第10天(P0.05),而SMX组、SZM组间的差异不明显。Wnt3a蛋白表达情况:横向比较:当细胞干预第5天时,SMX组、SGM组、SDM组的表达水平均与SAE组相比明显上调(P0.05);当细胞干预第10天时SZM组的表达水平较正常α组偏低(P0.05),其余组与正常α组间的比较无统计学意义。纵向比较:SAE组、正常α组第10天时的表达水平较第15天时明显增高(P0.05)。β-catenin的表达情况:横向比较:当细胞干预第5天时,正常α组与SAE组的组间比较无明显差异,其余4组的蛋白含量均明显高于这2组(P0.05);当干预到第10天时,仅有SZM组的含量比正常α组间增高(P0.05)。纵向比较:各组的组内表达水平相当(P0.05)。WISP1的表达情况:横向比较:干预第5天时,SGM组与SAE组间存在显著性差异(P0.05),其余各组与SAE组或正常α组的比较均无统计学意义。第10天时,SAE组的蛋白含量明显高于正常α组,其中正常α组、SGM组、SZM组的表达水平较与SAE组降低(P0.05),SDM组的蛋白含量高于正常α组(P0.05)。纵向比较:SAE组与SDM组第5天的表达水平均高于第10天(P0.05)。结论:1、采用全骨髓贴壁法从乳鼠胫股骨提取出原代骨髓间充质干细胞进行培养,且第3代细胞生长状态最佳。2、通过统计分析MTT结果,含药血清浓度为10%时,有利于细胞生长。3、本实验结果表明,无血清小气道上皮细胞培养基联合模型血清或麦门冬汤含药血清培养基可以诱导BMSCs向Ⅱ型肺泡上皮细胞分化;麦门冬汤可以激活经典Wnt/β-catenin信号通路来调节BMSCs往肺泡上皮细胞分化的机制。