定植于桉树根产酸克雷伯氏菌突变体的筛选及其功能基因

【摘要】：桉树(Eucalyptus robusta)是我国重要的经济树种,但其生长过程耗肥大,目前实际生产中大量施用化肥以满足其生长的营养需求,因此带来一系列负面影响。自生固氮菌能与多种植物形成联合固氮体系,具有一定利用的价值。本文从桉树林分离筛选出一株自生固氮菌,命名为KO108。采用PCR技术克隆16SrRNA基因可变区序列,在NCBI上的登陆号为KM460926.1。同时利用常规鉴定方法并结合Biolog微生物鉴定系统,鉴定该菌株为革兰氏阴性产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca),属于肠杆菌科(Enterbateriaceae)克雷伯氏菌属(Klebsiella) 。利用药敏试纸对菌株KO108进行抗生素抗性检测,结果表明该菌株对呋喃妥因、链霉菌、头孢曲松、卡那霉素、氧氟沙星、强力霉素、环丙沙星、氯霉素敏感；对复方新诺明中度敏感；对多粘菌素、青霉素G、四环素、红霉素不敏感,青霉素G对其的抑菌圈直径为0。以转座子[mTn5gusA-pgfp21]对产酸克雷伯氏菌KO108进行突变,筛选能定植于桉树根系表面的突变体,尝试建立一种木本植物与固氮细菌的互利促生体系。菌株KO108和Escherichia coli S17.1两亲结合,经转座子[mTn5gusA-pgfp21 ]结合转移并随机插入突变建立KO108的Kan抗性标记,GUS活性,GFP遗传标记的突变体库。随机选择突变体,以750bp GFP绿色荧光蛋白序列为探针Southern杂交,结果显示转座子[mTn5gusA-pgfp21]为单插入,片段大小不同,验证结果显示该突变体库随机性良好。以桉树根与突变体库共同培养筛选可以定植于桉树根的突变体,结果发现有2株较稳定地附着于桉树根系表面,编号为MA和MD,但野生菌株KO108不能定植于桉树根。以转座子[mTn5gusA-pgfp21]的GUS1和IS50R端各1条引物对Sau3A I的酶切MA和MD基因组的自连产物进行反向PCR,分别得到一段671bp和195bp的片段,通过NCBI数据库Blast比对结果显示MA的[mTn5gusA-pgfp21]插入位点所在片段与产酸克雷伯氏菌NAD(P)H醌类氧化还原酶基因核苷酸水平有87%一致性,而MD与产酸克雷伯氏菌LPS脂多糖生物合成基因簇核苷酸水平有99%一致性。采用Epicentre pWEBTM Cosmid Cloning Kit构建KO108基因组文库,克隆数目为1329个。通过EcoR I酶切分析随机挑取的20个文库克隆的重组质粒,结果显示所有质粒均有8.179 bp载体条带同时含有外源DNA,且外源DNA的带型并不相同,这表明所构建的K0108基因组文库中插入的外源DNA随机性较好。分析EcoR I酶切随机挑取的20个文库克隆的重组质粒的外源DNA电泳条带的大小,结果显示克隆的外源DNA片段最小约为25 kb,最大约为50 kb,平均大小估算为40 kb,文库克隆容量约52 Mb,证明该基因组文库包含基因组任意一个基因的概率为99.8%,是K0108基因组覆盖率的5倍。通过茵落原位杂交从K0108基因组文库中筛选到3个含有NAD (P) H(醌类氧化还原酶)基因的克隆,为进一步研究K0108中的NAD (P) H(醌类氧化还原酶)基因与该菌定植于桉树根系表面功能关系奠定了基础。