一株固氮细菌的全基因组分析与其WrbA基因功能的研究

【摘要】：本实验室在之前的研究中,从广西壮族自治区崇左市扶绥县东门镇采集桉树林地土壤,并利用无氮培养基筛选得到了一株固氮能力较强的细菌。经过Biolog微生物鉴定系统鉴定,该细菌为产酸克雷伯氏菌(Klebsiellaoxytoca),故将该菌命名为KO108。通过转座子[mTn5gusA-pgfp21]随机插入建立了KO108的突变体库,在建立一种桉树与固氮细菌互利促生体系的过程中,发现MA这一突变株能够较稳定地附着于桉树根系表面。在之前的研究中,已通过反向PCR确定了MA插入位点周围的序列。本研究对KO108进行全基因组测序,获得了全基因组的序列并对其基因进行功能注释。具体结果已上传NCBI(accession:NZ]LQMR00000000)。参考测序公司建议、实验室已进行的biolog检测结果和已有的文献资料,本文比对了克雷伯氏菌属(Klebsiella)、劳尔特氏菌属(Raoultella)及埃希氏菌属(Escherichia)下若干种细菌的rpooB,gyrA,mdh,infB,nifH基因,确认了该菌株为变栖克雷伯氏菌,并将该菌株命名为KV321。通过序列比对,确认了 KV321插入突变菌株MA的插入位点所在基因编码的是色氨酸阻遏结合蛋白(the tryptophan repressor-binding protein,WrbA)。本文将 KV321WrbA 蛋白序列与多个物种的类似蛋白进行了同源比对,并预测了该蛋白的分子量大小、疏水性、二三级结构等数据,为以后的蛋白分析奠定了一定基础。Blast结果表明,KV321 WrbA蛋白序列与大肠杆菌WrbA蛋白序列的相似度为88%,由于克雷伯氏菌WrbA蛋白报道较少,本文主要以大肠杆菌WrbA蛋白的研究成果作为参考。为了验证WrbA的功能,通过同源重组,成功构建了突变体MA的互补菌株MB。用渗透压冲击法提取了 KV321、MA、MB的粗蛋白。KV321粗蛋白在苯醌-NADH体系中的相对酶活达到24.99 μmol/min-mg,而MB粗蛋白在相同体系中的相对酶活为17.16μmol/min·mg,MA粗蛋白的同一指标只有7.19μmol/min·mg。对于铁氰化钾-NADH体系,KV32]粗蛋白的相对酶活力为1.87μmol/min·mg,MA粗蛋白为1.36μmol/min·mg,MB粗蛋白为2.41μmol/min·mg。而对于苯醌-NAIDPH体系,KV321粗蛋白的相对酶活力为 10.75μmol/min·mg,MA 粗蛋白为 5.16μmol/min·mg,MB 粗蛋白为10.16μmol/min·mg。对于铁氰化钾-NADPH体系,KV321粗蛋白的相对酶活力为0.5916μmol/min·mg,MA 粗蛋白为 0.16μmol/min·mg,MB 粗蛋白为 0.4116μmol/min·mg.mg。测量结果与大肠杆菌纯WrbA蛋白的结果一致:WrbA蛋白对醌的催化效果比铁氰化钾更好,对NADH的催化效果高于NADPH。这一结果验证了克雷伯氏菌WrbA蛋白也是一种醌类氧化酶,可能在应对外界氧化胁迫方面会发挥作用。本研究成功构建KV321 WrbA蛋白的表达载体pEtW,进行了 WrbA蛋白的诱导表达。本研究测量了KV321、MA、MB菌株的zeta电位,KV321 为-8.15mV,MA为-11.00mV,MB为-7.53mV。突变株MA的电位要低于KV321与MB,由于细菌表面电位与细菌的粘附性关系密切,故本文首次提出WrbA与细菌的表面电位及细菌的粘附性相关的猜测。但这一结论尚需要更多的证据来支持。