盐藻耐盐相关序列DSG10的功能预测及其转基因烟草鉴定

【摘要】： 盐藻(Dunalliena salino)是一种真核单细胞绿藻，可以在NaCl浓度为0.1～5.5mol／L的环境中生存。为了在基因表达水平上研究其耐盐机制，本实验室制作了盐藻在高渗震荡下的表达谱基因芯片，从中筛选到了一系列高渗震荡下差异表达的序列。本文的目的是，用生物信息学方法对其中一条序列DSG10进行功能预测，并将其转入模式植物烟草中，为下一步功能研究作准备。研究的主要内容包括：1、运用生物信息学方法对DSG10序列进行了分析，包括序列的读框分析、同源性比较、蛋白质结构分析、二级结构预测以及该序列的进化关系分析，初步预测该序列可能编码一种位于生物膜上的硝酸盐运输蛋白。2、首先构建了中间载pCAMBIA2301G，再用它和DSG10构建了可在植物中高效表达DSG10的载体pCAMBIA2301G-DSG10，并将该质粒导入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105中。3、叶盘法转化烟草(Nicotianatabacum)。烟草叶盘经农杆菌侵染后，在含卡那霉素的MS_2诱导培养基上生长，4周左右再生大量丛生芽，6周左右丛生芽在MS_3培养基中生根，生根率达到80％左右，最后将PCR检测的阳性苗成功移栽到蛭石：沙(1：1)的培养介质中培养。4、对转基因苗进行分子生物学检测，包括PCR检测和Southem杂交。结果显示有9％的再生苗为PCR阳性，对PCR检测阳性苗进行Southem杂交分析，发现DSG10已整合入烟草的基因组中，而且在这些苗中DSG10片段整合的拷贝数不同，部分PCR阳性苗Southern杂交结果却是阴性。