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成华猪白细胞介素—4基因克隆及表达效应研究

武梅  
【摘要】: 增强动物抗病防御和免疫应答能力,提高疫苗保护率是当前防治传染性疾病最可靠的简便途径。鉴于传统的药物治疗和常规疫苗接种已不能保障现代畜牧业的健康高效发展,动物免疫抑制和疫苗免疫应答及保护水平下降已严重制约对传染性疾病的防治。因此,研制和应用新型高效动物免疫增强剂对防治动物的传染性疾病具有十分重要的现实意义。近年来,随着分子生物学和免疫学的进展,表明细胞因子基因免疫增强剂不仅安全,而且可调节体液免疫和细胞免疫应答,适于多种抗原疫苗,具有广阔的前景。细胞因子DNA已被初步证实能够显著增强病毒和细菌以及寄生虫抗原基因的免疫应答。细胞因子作为疫苗的高效免疫增强剂已成为免疫佐剂研究的新方向。 鉴于白细胞介素-4是动物免疫应答调节中十分重要的细胞因子,国内外对猪淋巴细胞白细胞介素-4基因的研究甚少,还未见到对其在体内外转基因表达及其对动物免疫系统和免疫应答反应的深入研究;尤其是国内外还没有猪白细胞介素-4真核表达质粒作为分子免疫佐剂与其它分子免疫增强剂协同作用对猪常规疫苗免疫应答水平影响的研究报道。而白细胞介素-4在猪的免疫防御和免疫应答调节中发挥着非常重要的作用,因此,我们进行了猪白细胞介素-4基因的克隆及其在体内外转基因表达、对免疫系统和对猪瘟、猪肺疫和猪丹毒三联疫苗以及猪副伤寒疫苗的免疫应答的作用及机理进行了较系统的研究。 首先,我们将猪外周血淋巴细胞在Con A的刺激下培养48h后,应用RT-PCR扩增猪淋巴细胞白细胞介素-4基因,首次克隆报导了成华猪淋巴细胞白细胞介素-4基因(PIL-4),并在GenBank数据库中登记(登记号:AF493991)。序列分析表明PIL-4的cDNA长度为413bp,开放阅读框为402bp,由134个氨基酸残基构成,分子量15.0KDa,等电点8.24。将得到的序列在CenBank和EMBL数据库中进行了同源比较,结果表明它与来源于长白猪肠粘膜固有层淋巴细胞的白细胞介素-4有99%同源,与来源于杂交猪T细胞的白介素-4有96%同源,说明猪种及组织细胞来源的不同可能使基因有一定的差 成华槽自匆血介刁卜4吞旧义险及 纪 异。证明本实验克隆到了猪白细胞介素一的全基因。 第二,将克隆到的成华猪淋巴细胞白细胞介素叶基因亚克隆到真核表达 型载体 VR 020上,通过菌落 PCR的方法在转化子中筛选阳性克隆,用 B3m H I酶切初步鉴定重组子,用 BgllP PmaCI双酶切确定基因插入相位正确的 重组子。得到的重组真核表达质粒转染C朋7细胞株,RTqCR检测PIL-4 的转录表达:用猪淋巴母细胞增殖实验检测*几4在真核细胞中表达产物对 猪淋巴细胞的刺激活性;用小鼠脾淋巴母细胞增殖实验检测PIL4真核表达 产物对小鼠淋巴细胞的刺激活性;并通过吸附实验检测PIL-4在真核细胞中 表达产物与小鼠脾淋巴细胞上相应受体的吸附情况。结果表明:通过菌落 PCR和酶切分析,得到PIL*基因以正确插人方向的重组真核表达质粒,命 名为 VPIL-4:重组质粒转染 COS7细胞株后,RTPCR结果显示转染细胞总 RNA中含有PIL-4对应的InRNA:猪淋巴母细胞增殖实验证明VPIL4在转 染C。s7细胞株后,能够表达出有生物活性的猪PIL4蛋白质,对猪淋巴细胞 具有增殖作用;小鼠脾淋巴细胞母细胞增殖实验首次证实猪白细胞介素4能 够刺激小鼠脾淋巴细胞增殖,受体吸附检测表明P兀4在真核细胞中表达产 物能与小鼠脾淋巴细胞上的相应受体结合,为研究以小鼠作为实验动物探讨 PIL4的兔疫调节作用提供了可靠依据。这些结果表明已成功构建了能正确 表达PIL斗的真核表达质粒,其表达产物具有正常的生物学活性。 第三,探讨白细胞介素.4基因的真核质粒在动物体内转基因表达对动物 体液和细胞免疫的影响,增强白细胞介素-4基因真核质粒诱导动物体液和细 胞免疫应答的方法,是本项研究的重要目的之一。我们制备了阳离子脂质体 和纳米颗粒0LG);把VPL*质粒分别用脂质体和聚丙交酯乙交酯(PLG) 纳米颗粒包装,本实验还人工合成了80hp的兔疫刺激序列CpG短序,构建 了含有CpG基序的pUC18(pG质粒,与猪瘟猪肺疫猪丹毒三联茵和猪副伤 寒疫苗联合免疫小鼠,首次系统地研究了猪白细胞介素4基因的真核质粒在 不同免疫佐剂的协同作用下对小鼠细胞免疫和体液兔疫的影响情况;比较了 不同的免疫刺激分子影响小鼠对疫苗的体液和细胞免疫应答情况。实验结果 首次发现:在猪VPIL斗质粒作为免疫增强剂时,小鼠的总IgG和特异性抗 体水平比对照组显著升高;同时,兔疫细胞数量、淋巴细胞增殖活性和白细 胞介素.2的诱生活性明显增加;与阳离子脂质体及PLG纳米颗粒联合使用。 在减少质粒剂量的情况下,同样可以显著提高实验动物的IgG含量、免疫细 胞数量、淋巴细胞增殖活性及几-2诱生活性,


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