麻疯树（Jatropha curcas）毒蛋白（curcin）的分离纯化、基因克隆及作用机理研究

【摘要】： 麻疯树为大戟科麻疯树属植物，在我国的西南地区有着丰富的资源。麻疯树种仁中含有丰富的蛋白质，此蛋白质对人、小鼠及羊等是有毒的。以四川攀西地区采集的麻疯树为材料，分析了其种仁中总蛋白的含量和组成。采用硫酸铵分级分离和凝胶层析过滤法从麻疯树种仁中分离纯化出一种毒蛋白，称为麻疯树毒蛋白(curcin)，其相对分子量为28.2kDa，等点电为8.54左右。Curcin是一种糖蛋白，中性糖含量为4.91％。Curcin远紫外圆二色谱(CD谱)显示217nm处的单一负峰，此时的curcin分子中含有22.3％的a螺旋，43.5％的β折叠和34.2％的无规卷曲和转角。使用ABI491A蛋白测序仪测定了curcinN端前32个氨基酸的序列为：A-G／Y-S／K-T／A-P／D-T-L-T-I-T-Y-D-A-T／A-A-D-K-K-N-Y-A-Q-F-I-K-D-L-R-E-A-F／A-G。当curcin浓度大于7.8mg／L时，具有凝集兔红细胞的活性。用纯化出的curcin制备出抗此毒蛋白的兔抗血清，并用ELISA技术和Western杂交技术鉴定了抗体的滴度和特异性。 Curcin对无细胞系统中蛋白质合成的抑制活性较强，IC_(50)为0.19±0.011nmol／L；当curcin作用于大鼠肝核糖体经苯胺处理在3.5％聚丙烯酰胺的尿素变性胶电泳图上能观察到450bp的特征性核酸条带，从而证明curcin是RNAN-糖苷酶，它的作用机制是通过失活真核生物核糖体而抑制蛋白质的合成，因此认为curcin也是一种核糖体失活蛋白(RIPs)。体外生物学活性试验表明，curcin具有抑制胃癌细胞(SGC-7901)、小鼠骨髓瘤细胞(Sp2／0)、人肝癌细胞(Human 四川大学博士学位论文 hePatoma）的体外增殖的能力，其 IC50分别为 0．23土0刀04 mg／L，0．66土0刀15 mglL和 3．1610．03 mg／L，但对 HeLa细胞和正常细胞无毒；在电脉冲介导下， curcin处理HeLa细胞后，细胞的存活率明显降低；显微镜下观察，可见到明显 的凋亡细胞，流式细胞仪测定细胞周期的＊期前有亚二倍体的凋亡峰，DNA 凝胶电泳未显示有规律断裂形成的DNA梯状图谱；小鼠急性毒理实验结果表 明，小鼠灌胃半致死剂量LD扣为 104．737士29．447mg／kg；小鼠腹腔注射半致死 剂量 LD50为 67．20土 10．445 og／kg。 依据curcin的N－端部分氨基酸设计简并引物，通过反转录聚合酶链式反应 （RT－PCR）和快速分离cDNA末端（RACE）技术扩增得到curcin全长cDNA （Ge姻毗注册号 AY069946）。该 cDNA全长由N 73个碱基组成，包含一 个完整的编码 193个氨基酸的开放阅读框，构成一个 32 kDa的前体蛋白，成熟 蛋白由 251个氨基酸组成，前 42个氨基酸为信号肽，推导的多肽序列与已测出 的蛋白质的N．端序列相同。在起始密码子上游有一个由36个碱基组成的5’非 编码区；在终止密码子下游有一个由236个碱基组成的3’非编码区，包括两个 加 poly（A）信号和一个长度为 ZI个腺昔酸的 poly（A）尾。根据 curcin的 cDNA序 列设计引物，采用基因组步查技术克隆了麻疯树基因组中的一个 1802 hP DNA 片段（GenBank注册号 AF 469003）。序列分析结果表明，该基因也包含了同 上的开放阅读框，在5’端，除具有36个核昔酸外，还包含一个658核昔酸的5’ 上游序列，含有一个推测的TATA盒和两个CAAT盒；在丁端，也存在两个加 poly（A）信号，其序列有两处与CDNA基因不同。该基因的编码区具有核糖体失 活蛋白基因的特征：无内含子。 将编码 curcin的成熟蛋白（FLZ）和保守结构域（CB）基因定向克隆到 pQE－30质粒后，获得重组质粒pQE－JI（FLZ－pQE－30）和pQE－JZ（CBlpQE－30）。 用该重组质粒转化大肠杆菌M15菌株。结果表明，在IPTG诱导条件下，编码 curcin成熟肽和保守结构域的基因都得到了表达。表达产物仍具有体外抑制蛋 白质合成的能力，蛋白质生物合成被抑制50％时的表达的融合蛋白的浓度r。 分别为 0．32土0．038 nmoUL（CBI）和 0．44士0．016 nmol／L（FLZ），说明成熟蛋 白N端的前8个氨基酸和C端后5个氨基酸对其活性无影响。