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肝素酶高产菌株的选育及其酶学性质的研究

罗璠  
【摘要】: 从成都附近的肠衣厂,屠宰厂等地采集土样和水样。采用肝素钠和鱼卵精蛋白相结合的筛选方式进行平板初筛,再通过测定菌体发酵液和无细胞提取液中肝素酶活力的方法摇瓶复筛。通过这一筛选模型,经反复分离筛选,得到一株肝素酶产生菌。经诱导酶及胞内酶的检测,证明该菌产生的肝素酶是一种诱导型的胞内酶,且肝素是其诱导物。以枯草芽孢杆菌为对照,并辅以大肠杆菌,经形态观察和生理生化实验,初步鉴定该菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。 为提高肝素酶的产量,对菌株进行紫外线和LiCl复合诱变,首先对菌株进行40s的紫外照射(诱变致死率为80%),挑选酶产量最高的菌株进行下一轮诱变。通过三次紫外线诱变,挑选到突变株B.S.Lx—10,其肝素酶产量较出发菌株提高了26.6%。再采用紫外线和LiCl复合诱变,选择LiCl浓度为0.7%(此时致死率为80%左右),选育到突变株B.S.Lx—19,其肝素酶产量较出发菌株提高了40%。 通过单因素条件研究,发现N源和C源对酶产量影响较大,接种量以10%,初始pH6.5,种龄12h为宜。再进行正交分析优化菌B.S.Lx—19的发酵条件,其发酵培养基组成为(%):大豆蛋白胨1.2;麦芽糖1.2;肝素钠0.1;K_2HP_O_40.5;NaH_2PO_40.25;MgSO_4·7H_O,pH6.5。在通气量为1:0.5~1:1,转速400rpm,2L的发酵罐中,37℃的条件下发酵一天,其肝素酶活力为724U/L。 采用饱和度为30%℃60%的硫酸铵分级沉淀B.S.Lx—19的无细胞粗提液。对该酶进行了酶学性质研究及产物分析。结果发现,该酶作用的最适pH为6.5,最适温度为37℃;在pH5~8之间稳定,其热稳定性不高。Ca~(2+)和Mn~(2+)对酶有一定的促进作用,而Cu~(2+)和Fe~(3+)对酶反应有明显的抑制作用。PMSF和EDTA 均不影响酶活性。在产物分析中发现,该酶作用于肝素后,还原糖数量明显增 加,通过红外色谱及质子谱的分析发现,产物中出现了含不饱和双键的还原寡 糖,这是肝素酶作用于肝素后的特异性产物,从而可以进一步证明该菌确实产 生肝素酶。


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