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蜂王浆超氧化物歧化酶分离纯化及部分性质研究

闵丽娥  
【摘要】: 对意大利工蜂及意大利工蜂蜂蛹、蜂王浆、蜂蜜、荞麦花粉和油菜花粉中超氧化物歧化酶(SOD)的分布进行了研究,发现这几种蜂产品中都含有SOD活性,这些蜂产品SOD活力顺序为:蜂蛹〉蜂王浆〉蜂蜜〉工蜂〉荞麦花粉〉油菜花粉。以蜂王浆为材料,经过硫酸铵分段盐析,DEAE-Sepahrose柱层析和Seohacryl S-200凝胶过滤,得到了纯化SOD。产率2.98%,纯化倍数104.0,比活53.05U/mg,该SOD经PAGE和SDS-PAGE中都显示单一蛋白区带。以邻苯三酚自氧化法为酶活力测定方法,发现该酶最适pH为8.3,研究了Cu~(2+)、Ba~(2+)、Mg~(2+)、Mn~(2+)等离子对酶活力的影响。发现Cu~(2+)、Ba~(2+)、Mg~(2+)、Mn~(2+)对SOD有不同程度的激活作用。其中,激活作用最强的是Cu~(2+)。研究了温度对SOD活力的影响,发现该酶在55℃保温15分钟后,酶仍然保留62%的酶活力,在70℃保温15分钟后仍有20%的酶活力。还研究了Cu~(2+)存在下温度对酶活的影响,发现在有Cu~(2+)存在下,70℃保温15分钟后测得的酶活比25℃下所测酶活更高。酶敏感性实验发现该酶对H_2O_2敏感,对乙醇和氯仿稳定,表明该酶为Cu/Zn-SOD。用220FS Atomic Absorption Spectrometer测定了酶液中Cu、Zn、Fe、Mn的含量,发现该酶液中只含有Cu、Zn。经计算,每个亚基含1.6个Cu原子和3.3个Zn原子。用SDS-PAGE测得该Cu/Zn-SOD的相对分子质量为5.0×10~4,考察了BrAC和DTT对酶侧链修饰的情况,发现BrAC明显抑制酶活力,抑制程度与BrAC浓度成正相关。DTT对酶活力的影响可以分为两个阶段,低浓度DTT抑制酶活力,而较高浓度DTT则对酶活有激活作用。脲的加入明显地抑制酶活力。脲的浓度为2mol/L时,酶完全失去活力。 用UV-VIS spectrophometer TU-1800测定了酶的紫外光谱,发现该酶的最大紫外吸收在260nm左右而不是280nm。BrAC对酶的修饰引起酶最大紫外吸 收不断变小。DTT对酶的修饰引起酶的最大紫外吸收不断变大,最大吸收波长 不断发生红移。向酶液中加入眠后,酶的最大紫外吸收变大,但随着眠浓度的 增大,紫外吸收变小。 用 FL4500-iuorence nctrophotometer测定了不同浓度的 BrAC和 D*修 饰后酶的荧光光谱变化。BrAC和DTT修饰后均引起酶的荧光发射峰强度变小, 但并没有引起发射峰位置的显著改变。酶液中加入腺后引起酶的荧光发射峰强 度变小。 用从8*0600C型自动记录分光偏振仪测定了酶的圆二色谱。经计算, 酶的口螺旋和p折叠和无规卷曲的含量分别为26.125%,53.83%和22.02%。 圆盘等电聚焦电泳测得酶的等电点为4.69,4.85和5刀1。NR/R-单向和双向 SDS.PAGE表明该酶含有链内二硫键。用日立835-50型高速氨基酸分析仪测 定了酶的氨基酸组成,发现该酶由约402个氨基酸残基组成,其中ASp、Gly、 LeU、AI*、Gill、Val的含量较高。


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