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一种接有仿LDL受体功能结构短肽SDE的LDL亲和吸附剂的研究

余喜讯  
【摘要】: 目前,心血管疾病正日益严重地危害人类健康,而动脉粥样硬化在其发病过程中起着重要作用,业已证明人体血液中运输胆固醇的低密度脂蛋白(Low Density Lipoprotein,LDL)的升高及由此而引起LDL进入血管壁中并被氧化成氧化型的低密度脂蛋白是其主要原因。高密度脂蛋白(High Density Lipoprotein,HDL)在胆固醇代谢中起良性作用,能阻止动脉粥样硬化的形成及恶化。因此,国内外学者都致力于如何设法降低LDL的水平而又不引起HDL损失的研究工作。近年来,去除LDL的血液净化疗法逐渐应用于临床,其中的吸附剂吸附法由于对LDL具有选择性吸附,所以取得了较好的疗效。本论文以丝氨酰-天冬氨酰-谷氨酸(SDE)负电性三肽(此三肽广泛存在于LDL受体配体结合域7个重复序列的羧基末端,对LDL受体特异性识别LDL起着重要作用)作为配体固定到聚丙烯酰胺微球载体上制成仿生性LDL亲和吸附剂,考察其对人血浆中LDL及HDL的吸附功效。 本文用反相悬浮聚合法合成符合LDL吸附剂载体要求的聚丙烯酰胺微珠,经实验筛选出反应体系所需的最佳单体浓度(12%)、最佳分散剂用量(0.65%)、最佳油水比值(1:3)、最佳单体(AAM)与交联剂(MBA)的物质的量之比(18:1)。按此配方合成的聚丙烯酰胺微珠呈规则的球形,平均粒径为111.8μm,平均孔径为119.8nm,这些均符合LDL吸附剂载体的要求(粒径为100~200μm、平均孔径为100~200nm)。与国外同类产品相比,本实验室合成的聚丙烯酰胺微珠成 余喜讯:一种接有仿LDL受体功能结构短肽(SDE)的LDL亲和吸附剂的研究 本大大降低。 本文进行了丝氨酸、天冬氨酸及谷氨酸三种氨基酸的保护。按照从梭基端 到氨基端的合成路线,用风N’-二环己基碳二亚胺(DCC)/l-羟基苯骄三氮哩 (HOBt)液相合成法逐步接肽,制备得到对应的带保护基的中间体,用催化氢 化还原脱去所有的保护基。最后产物利用柱层析法和薄层层析法相结合的梯度 洗脱法纯化。最终产物经薄层色谱、氨基酸分析、质谱及液相色谱一质谱联用 等检测手段分析,证明是纯度很高的丝氨酸一天冬氨酸一谷氨酸三肽,符合作 为吸附剂配体的需要。 通过改变聚丙烯酚胺微球上的活性基团,并接上不同长度的碳氢臂制得含 有不同长度手臂的载体。在此基础上,以戊二醛或l-乙基l(3-二甲基氨丙基卜 碳二亚胺旧DC)为偶联剂将SDE配体连接到载体上制成吸附微珠。经红外、 XPS、生化检测等分析,表明SDE配体成功地偶联到了载体上。同时对影响SDE 配体固定化量的各种因素也做了初步的探讨,结果如下:戊二醛固定化SDE配 体的最适条件为:SDE配体的初始浓度为sing/ml(载体用量为sg,湿重)时, 效率最高;活化载体时的pH值为7刀;戊二醛的活化浓度为5%:偶联时的pH 值为 7刀;偶联时间不少于 4小时。EDC固定化 SDE配体的最适条件为:偶联 时的pH值应保持在4石4.8;浓度要大大超过SDE配体的浓度;反应时间不少 于12小时。 通过体外静态吸附对各种吸附微珠的吸附性能进行了研究,结果发现本类 吸附微珠对 LDL有亲和吸附能力。在无 Ca》的吸附体系中,各吸附微珠的吸附 性能相对较低。当加入高浓度的CaZ”后,吸附微珠对LDL的吸附有明显提高, 对 HDL的吸附也有增高,但不如 LDL明显。其可能的原因是:在吸附体系中 如存在大量的 Cay,一方面 Ca*可以作为桥梁连接 LDL所含磷脂极性头部的 磷酸基团和吸附微珠配体上的孩基;另一方面又可交联相邻磷脂间的磷酸基团, 从而促进LDL所含磷脂极性头部的胆碱N”与配体竣基的相互作用。这两者均 增大了LDL吸附到吸附微珠上的机率,进而提高了吸附率。另外,从空间构象 来考虑,当向吸附体系中加入CaZ”后,固定于载体表面或其孔洞内的多个相邻 配体及其间隔臂分子围绕钙离子可能形成一个有利于L*L结合的八面体结构, 这样也利于本吸附剂对LDL的吸附。研究还表明,用戊二醛固定化配体制成的 吸附微珠的吸附效果比用EDC偶联配体制成的吸附微珠好,这可能是因为:一 互l 四川大学博士学位论文 方面,用戊二醛固定化配体制成的吸附微珠的表面含有更多能与LDL相互作用 的基团(COOH),有利于 LDL的吸附;另一方面,从空间结构来看,用 EDC 偶联配体制成的吸附微珠由于有带正电荷的氨基的介入,可能不利于前述八面 体空间构象的形成,进而不利于LDL的吸附。


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