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蕹菜类囊体膜磷酸酯酶的分离纯化和性质研究

刘映秋  
【摘要】: 蛋白可逆磷酸化几乎可以调节所有的细胞活动,包括代谢过程、基因表达调控、细胞周期调控、运输和分泌过程、细胞骨架的形成和细胞粘连。而Bennett(1977)发现的类囊体膜蛋白可逆磷酸化已成为近年研究的热点之一,蛋白质连上或是移去磷酸基团都将强烈影响蛋白质的生理活性和性质,这需要类囊体膜蛋白激酶和磷酸酯酶的参与。类囊体膜蛋白的可逆磷酸化是一个动态平衡过程,蛋白质磷酸化和去磷酸化受光照控制。迄今人们对类囊体蛋白磷酸酯酶的研究较少,为了研究可逆磷酸化对PSII反应中心结构与功能的影响,本文以蕹菜为材料,从叶绿体类囊体膜中分离纯化到一种膜结合蛋白磷酸酯酶,进行了酶学性质和光谱性质的研究。 使用NaCl抽提、硫酸铵分步沉淀、离子交换和Butyl-Toyopearl 650M疏水柱层析等方法,从蕹菜叶绿体类囊体膜中分离纯化到一种蛋白磷酸酯酶。SDS-PAGE检测表明这种磷酸酯酶的分子量为14.9kD。该酶具有水解磷酸单酯类物质的活性,水解pNPP的Km值为1.76×10~(-6)mol/L。体外测活时最适pH为5.0,属于酸性磷酸酯酶。该酶耐热,在50℃时活力达到最高,对NaCl不太敏感。但EDTA和NaF可以明显影响该酶的活性。同时,也借助蛋白质内源荧光和活力测定,考察pH、温度、NaF和二价金属阳离子等因素对溶液中磷酸酯酶构象的影响。其中在pH5.0及以下时,蛋白质的三级结构变得松散,荧光强度下降,pH5.0时尤为显著,而当溶液pH高于5.0时(酶的最适pH),样品的荧光发射强度明显增加,表明酶蛋白受溶液酸碱度的影响,构象发生部分变化,部分Trp残基向疏水环境移动,其三级结构得到恢复。在10-30℃范围内,蛋白荧光峰位置和强度变化不大,而在40-90℃范围内荧光强度升高再下降,其中,50-60℃时样品内源荧光的发射强度最高,说明当温度在50-60℃时,蛋白质分子可能比较紧密,芳香族氨基酸残基位于蛋白质分子的疏水内部。NaF强烈抑制此酶,不同浓度的NaF使荧光强度有不同程度的下降。EDTA对此种磷 酸酣酶也有抑制作用,因此用7种二价阳离子处理磷酸酷酶,发现不同金属二 价阳离子对这种磷酸酷酶活性和荧光发射光谱的影响不同,因此二价阳离子调 控此酶活性,但可能与荧光光谱所反映的三级结构变化无关。


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