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枯草芽孢杆菌6-磷酸葡萄糖脱氢酶的分离纯化和部分性质

莫宏春  
【摘要】: 枯草芽孢杆菌通过超声破壁、(NH_4)_2SO_4分段盐析、DEAE-Sepharose FF离子交换层析、Blue Sepharose CL-6B亲和层析、Sephadex G-200凝胶过滤等纯化步骤,分离出6-磷酸葡萄糖脱氢酶(G6PD)。经PAGE和SDS-PAGE检测为单一蛋白区带,比活力为1.7375IU/mg,纯化倍数为72.7,收率为13.6%。凝胶过滤法测定该酶表观分子量约为220kD,SDS-PAGE测定亚基分子量约为50.5kD,可见该酶是由四个相同亚基构成的四聚体。等电聚焦电泳测得等电点为6.3,用动力学方法测得该酶的最适反应pH为8.5,最适反应温度为37℃,以6-磷酸葡萄糖(G6P)为底物的Km值为0.177mmol/L。 考察了部分金属离子及EDTA对该酶活性和紫外、荧光光谱的影响:Mg~(2+)起激活作用;Zn~(2+)低浓度时表现激活作用,高浓度时表现抑制作用;Ag~+、Fe~(2+)起抑制作用;而EDTA和Mn~(2+)基本无影响。部分金属离子使G6PD的构象发生改变,发色团所处的微环境随之发生变化,使紫外吸收峰变宽变平。Ag~+和Fe~(2+)引起色氨酸(Trp)残基的荧光淬灭;Mg~(2+)和EDTA均使G6PD的荧光强度增强,说明它们使Trp残基重新包裹在分子内部而处于疏水的微环境中;Zn~(2+)和Mn~(2+)均使G6PD的荧光强度变小,说明它们使酶分子构象变得疏松,原来处在分子内部的发色团暴露在极性环境中。 天然G6PD的远紫外圆二色谱显示在208nm和222nm两处的双负峰曲线,说明α-螺旋含量高,此时含有41.2%的α-螺旋,20.6%的β-折叠和38.2%的无规卷曲及其它构象单元。 用常见的荧光淬灭剂丙烯酰胺和KI研究G6PD分子中Trp残基的微环境, 发现它们对分子中T印残基的荧光均有淬灭作用,丙烯酸胺能淬灭100%的荧 光,Kl能淬灭78%的荧光,表明分子中小部分饰残基埋藏在分子内部,大 部分T印残基处于分子表面的极性环境中。


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