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诸葛菜(Orychophragmus violaceus)及甘蓝型油菜(Brassica napus)Toc33基因编码区的克隆与分析

廖问陶  
【摘要】: 本论文主要内容包括在诸葛菜和甘蓝型油菜中分别克隆得到2个Toc33基因全编码区序列,对这4个序列进行了同源性分析比较。提取了甘蓝型油菜总RNA,通过RT-PCR获得了甘蓝型油菜Toc33cDNA,并对所获得的这几个基因序列以及拟南芥、豌豆和玉米中的Toc33,Toc34序列进行了同源性分析。 根据已报道的拟南芥Toc33基因编码区序列,设计一对寡核甘酸引物,以诸葛菜和3529油菜总DNA为模板,进行PCR扩增,结果均扩增得到两条大小相近,约为1500bp的扩增带。将这4条带分别纯化回收,与T载体连接克隆转化得到了这4个DNA片断。对这4个序列进行了序列测定,测序结果通过blast进行同源性比较,结果显示我们成功克隆得到了4个Toc33基因全编码区序列。参考拟南芥Toc33基因序列确定了其开放阅读框架,每个片段均含有7个外显子和6个内含子。其中从诸葛菜获得的2个片段分别长为1475bp和1573bp,从3529油菜获得的2个片段分别长1370bp和1490bp。序列比较显示所克隆得到的这4个Toc33基因,其外显子部分与拟南芥Toc33基因外显子区域均有很高的同源性,而相应的内含子区则差别较大。 根据Toc33基因的外显子序列推导得到了其所编码的氨基酸序列,该序列为一个由297个氨基酸残基组成的蛋白质,分子量约为33KD,含有一个 四川大学硕士学位论文 保守的GTP结合区(40-50位氨基酸)和一个疏水区域(265趁79位氨基酸), 该位置可以形成。螺旋的跨膜区段,对这些氨基酸序列进行同源性分析显示, 它们之间以及与拟南芥Toc33蛋白序列都存在着相当高的同源性,说明这个 蛋白质是相当保守的。同时,这几个氨基酸序列与另一个叶绿体外膜蛋白转 运器构件蛋白Toc34也存在着一定程度的同源性。 提取3529油菜幼叶期总RNA,通过RT一PCR技术反转录扩增得到油菜 Toc33cDNA全编码区序列,。开放阅读框长894bP,编码297个氨基酸序列, 将该氨基酸序列进行同源序列比较分析,可以发现Toc33蛋白有较高的保守 性,它与拟南芥Toc33氨基酸序列的同源性达到94.6%,与之前从诸葛菜和甘 蓝型油菜Toc33基因推导而来的氨基酸序列同源性分别达到93%,93 .6%, 97.4%,98%。


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